乳酸片球菌AS185調節(jié)高脂高糖飲食誘導的代謝綜合征

張 麟，高 磊，王 超，趙子健，段翠翠，趙玉娟，楊 舸，李盛鈺,*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林 長春 130033；2.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

代謝綜合征是一組復雜的代謝紊亂癥候群，是城市化和生活方式的改變，特別是將常規(guī)飲食改為高脂、高糖飲食造成的[1]。代謝綜合征是導致肥胖、高血脂、糖尿病和心血管疾病等的危險因素[2]，因此其診斷和治療方案也越來越受到重視。

益生菌被定義為公認食用安全的活的微生物，攝入足夠數(shù)量時，對宿主的健康有促進作用。益生菌是一類重要的功能性食品原料，因其在調節(jié)腸道菌群、改善便秘和腹瀉、抑制有害微生物、調節(jié)免疫系統(tǒng)功能、預防腫瘤等方面的潛在功效而受到消費者的關注[3-7]。特別是其在減肥、調節(jié)血脂和降低血清膽固醇、降血糖、抗動脈粥樣硬化等代謝調控紊亂相關疾病防治方面的作用[8-12]。

乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）是一種革蘭氏陽性球菌，在商業(yè)發(fā)酵過程中廣泛用于生產(chǎn)普通食品[13]。有研究報道，通過口服乳酸片球菌R037可以減輕慢性炎癥并調節(jié)免疫反應，成功緩解了動脈粥樣硬化[14-15]。乳酸片球菌AS185是本實驗室自主分離鑒定的一株乳酸菌新菌株，前期研究表明，該菌株具有較好的黏附和耐受能力，并通過調節(jié)血脂、抑制炎癥因子及黏附分子改善抗動脈粥樣硬化癥狀[16]。因此，推測乳酸片球菌AS185具有減輕不健康的血脂異常狀態(tài)和抑制炎癥的能力，可能適用于改善代謝綜合征，但其作用和機制還需進一步深入研究。本研究考察乳酸片球菌AS185對高脂高糖誘導代謝綜合征模型小鼠的治療作用和機制，為其開發(fā)成食品、保健品、藥品等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、菌株與試劑

45 只7 周齡（體質量35～50 g）清潔級ICR雄性健康小鼠，購于長春市億斯實驗動物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）2011-0004。進行為期1 周的適應性喂養(yǎng)，動物房溫度（21±2）℃、相對濕度（40±10）%，采食和飲水由小鼠自由進行。

基礎飼料和高脂飼料（83.3%（質量分數(shù)，下同）基礎飼料+10%豬油+3%膽固醇+3%白砂糖+0.5%的膽酸鈉+0.2%丙基硫氧嘧啶）均由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供。

實驗菌株AS185是從吉林省延吉地區(qū)傳統(tǒng)農(nóng)家大醬中分離獲得的一株乳酸菌新菌株，經(jīng)API 50 CHL鑒定系統(tǒng)和16S rDNA序列比對，鑒定為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏登記號為CCTCCNO：M2018114[17]。

總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）檢測試劑盒 南京建成生物技術公司；小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、胰島素（insulin，INS）、游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）、C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒 上海江萊生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒北京鼎國昌盛生物技術有限公司；兔抗核因子κ B（nuclear factor kappa-B，NF-κB）抗體、兔抗磷酸化NF-κB（phosphorylation NF-κB，p-NF-κB）、兔抗Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）單克隆抗體、兔抗髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）單克隆抗體、兔抗肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）單克隆抗體 英國Abcam公司；腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate activated protein kinase，AMPK）、磷酸化AMPK（phosphorylation AMPK，p-AMPK）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、磷酸化ACC（phosphorylation ACC，p-ACC）、固醇調節(jié)元件結合蛋白1c（sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c）單克隆抗體 北京博奧森生物技術有限公司；山羊抗兔二抗 北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

超高速冷凍離心機 美國Thermo公司；血糖儀瑞士Roche有限公司；ELx800全自動酶標儀 美國BioTek公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；SQ810C型高溫高壓滅菌鍋 重慶雅瑪拓科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

連續(xù)活化3 代的乳酸片球菌AS185菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃靜置培養(yǎng)16 h后，將菌液在4 ℃、4 000×g條件下離心15 min，棄上清液，取菌泥用滅菌生理鹽水洗滌1 次，并調整活菌數(shù)濃度為1×109CFU/mL，備用。

1.3.2 造模方法與分組

表1 動物實驗方案Table 1 Grouping of experimental animals

按參考文獻[18]的方法，小鼠隨機分為3 組，每組15 只（表1）。每2 周測體質量并尾靜脈取血測定斷食不斷水12 h的空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）濃度1 次。造模結束后，禁食12 h后，尾靜脈取血測FBG測定、血脂水平（TC、TG、LDL-C、HDL-C）并檢測體質量。飼養(yǎng)6 周結束后，模型組和AS185組小鼠滿足以下條件中任意2 項即為代謝綜合征模型造模成功小鼠[19]：1）體質量高于對照組小鼠體質量20%；2）血清中血脂水平改變，即TC、TG、LDL-C水平升高和HDL-C水平降低；3）胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，IR）升高。最終，各組篩選出10 只符合模型納入標準的小鼠用于后續(xù)實驗。其中，AS185組灌胃乳酸片球菌AS185菌懸液（1.0×109CFU/mL），劑量為每日12 mL/kg，對照組和模型組給予等體積的無菌生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃8 周（第7～14周）。每2 周測定體質量及FBG濃度。末次灌胃后，眼球采血，4 ℃、3 000×g條件下離心10 min，收集血清，－80 ℃凍存；斷頸處死后，解剖，摘取肝臟，－80 ℃凍存，備用。

1.3.3 血清生化指標測定

血脂指標（TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA）、血清炎癥指標（TNF-α、IL-6、IL-1β、CRP和LPS）及INS水平檢測，按照試劑盒說明書方法操作。利用穩(wěn)態(tài)模型（homeostasis model assessment，HOMA）評估胰島素抵抗（insulin resistance，IR）指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR按照下式計算。

1.3.4 Western Blot檢測蛋白表達

根據(jù)文獻[20]的方法，取各組小鼠肝臟50 mg，加入適量蛋白裂解液勻漿，離心收集上清液，采用BCA法測定總蛋白質量濃度。首先，加上樣緩沖液同時沸水浴10 min使蛋白變性，－20 ℃冷藏，備用；之后進行蛋白電泳分離，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（濃縮膠60 mV電壓，30 min；分離膠120 mV電壓，120 min），隨后60 mV電壓，90 min轉膜至PVDF膜；室溫封閉60 min，3%牛血清白蛋白封閉液于搖床上進行封閉；最后孵育一抗，TBST洗膜3 次，每次7 min，并分別加入TLR4、NF-κB、p-NF-κB、LKB1、AMPK、p-AMPK、ACC、p-ACC、SREBP-1c等抗體，4 ℃反應過夜；次日，以TBST洗膜3 次，每次10 min；再加入HRP標記的山羊抗兔IgG（稀釋體積比為1∶3 000），常溫下反應1 h；再用TBST洗膜4 次，每次5 min；采用電化學發(fā)光法曝光，并用Image J軟件進行半定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

分析處理數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5軟件進行繪圖，使用SPSS 23.0軟件的單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行差異顯著性比較，結果均以±s表示。

2 結果與分析

2.1 乳酸片球菌AS185對代謝綜合征模型小鼠體質量、INS、FBG及HOMA-IR的影響

表2 乳酸片球菌AS185對高脂高糖誘導代謝綜合征模型小鼠體質量的影響Table 2 Effect of P.acidilactici AS185 on body mass of mice with metabolic syndrome induced by high-fat and high-fructose diet

由表2可知，AS185組體質量雖呈上升趨勢，但與模型組相比，上升趨勢緩慢，并在第12周和第14周體質量與模型組相比出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），說明乳酸片球菌AS185具有緩解高脂高糖飲食誘導代謝綜合征的體質量上升的趨勢。

表3 乳酸片球菌AS185對代謝綜合征模型小鼠INS、FBG、HOMA-IR的影響Table 3 Effect of P.acidilactici AS185 on INS, FBG and HOMA-IR of mice with metabolic syndrome induced by high-fat and high-fructose diet

由表3可知，14 周后，與模型組相比，AS185組小鼠血清中的INS和FBG水平也呈下降趨勢，同時HOMA-IR降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明乳酸片球菌AS185對代謝綜合征具有改善胰島素抵抗的作用。

2.2 乳酸片球菌AS185對高脂高糖誘導代謝綜合征模型小鼠血脂水平的影響

表4 乳酸片球菌AS185對代謝綜合征模型小鼠血清TC、TG、LDL、HDL、FFA水平的影響Table 4 Effect of P.acidilactici AS185 on serum TC, TG, LDL, HDL and FFA levels of mice with metabolic syndrome induced by high-fat and high-fructose diet

由表4可知，高脂高糖飲食誘導的代謝綜合征小鼠血脂代謝出現(xiàn)紊亂，與對照組比較，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C及FFA的水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；同時，HDL-C水平有降低趨勢；而與模型組相比，AS185組小鼠血脂指標TC、TG、LDL-C、FFA的水平也均降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），這說明乳酸片球菌AS185能夠改善代謝綜合征小鼠的血脂代謝紊亂。

2.3 乳酸片球菌AS185對代謝綜合征模型小鼠血清炎癥因子水平的影響

表5 乳酸片球菌AS185對高脂高糖誘導代謝綜合征模型小鼠血清炎癥因子水平的影響Table 5 Effect of P.acidilactici AS185 on inflammatory factor levels of mice with metabolic syndrome induced by high-fat and high-fructose diet

由表5可以看出，代謝綜合征會誘發(fā)小鼠體內慢性炎癥，與對照組相比，模型組小鼠的血清中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP及LPS的水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，AS185組小鼠血清中的IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP、LPS水平均有降低趨勢，其中IL-1β、TNF-α、IL-6、CRP差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。以上結果提示，乳酸片球菌AS185有改善代謝綜合征小鼠血清中的炎癥水平，進而緩解機體慢性炎癥狀態(tài)的可能。

2.4 乳酸片球菌AS185對代謝綜合征模型小鼠臟組織蛋白表達的影響

2.4.1 肝組織中TLR4/MyD88/p-NF-κB炎癥通路蛋白的表達

圖1 乳酸片球菌AS185對高脂高糖飲食誘導的代謝綜合征模型小鼠肝臟炎癥通路蛋白表達的影響Fig.1 Effect of P.acidilactici AS185 on the expression of proteins associated with inflammatory signaling pathways in liver of mice with metabolic syndrome induced by high-fat and high-fructose diet

由圖1可知，與對照組相比，模型組小鼠肝臟中TLR4、MyD88及p-NF-κB蛋白表達水平極顯著上升（P＜0.01），表明代謝綜合征誘發(fā)了肝臟的炎性反應，使機體出現(xiàn)慢性炎癥；經(jīng)乳酸片球菌AS185治療后，小鼠肝臟中TLR4、MyD88及p-NF-κB表達水平顯著降低（P＜0.05），NF-κB總蛋白水平無顯著變化，說明p-NF-κB水平的改變并不是因為NF-κB總蛋白表達的變化而引起的，而是因為上游MyD88活化引起，說明乳酸片球菌AS185能抑制高脂高糖飲食誘導中TLR4、MyD88及p-NF-κB的表達，降低了肝臟的炎性損傷，緩解機體慢性炎癥。

2.4.2 肝組織中LKB1/AMPK/p-ACC脂代謝通路蛋白的表達

圖2 乳酸片球菌AS185對代謝綜合征模型小鼠肝組織脂代謝通路蛋白表達的影響Fig.2 Effect of P.acidilactici AS185 on the expression of proteins associated with lipid metabolism signaling pathways in liver of mice with metabolic syndrome induced by high-fat and high-fructose diet

由圖2可知，與對照組相比，模型組小鼠肝臟中LKB1、p-AMPK、p-ACC表達水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），SREBP-1c水平極顯著升高（P＜0.01），表明高脂高糖能夠引起小鼠的脂代謝紊亂；結合圖1進一步說明，機體出現(xiàn)慢性炎癥的同時會伴隨脂代謝紊亂的出現(xiàn)。經(jīng)乳酸片球菌AS185治療后，小鼠肝臟中LKB1、p-AMPK和p-ACC表達水平顯著升高，SREBP-1c蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。以上結果表明，乳酸片球菌AS185能夠干擾LKB1介導高脂高糖對代謝綜合征小鼠誘導的肝臟AMPK和ACC磷酸化的作用，并抑制SREBP-1c成熟，改善機體脂代謝的紊亂。

3 討 論

高糖高脂飲食導致的胰島素抵抗與系統(tǒng)性低水平炎癥密不可分。Mansyur等[21]發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗的發(fā)展與炎癥有關，幾種炎癥標記物表現(xiàn)出臨床重要性，包括CRP、白細胞、纖維蛋白原和白蛋白，高三酰甘油血癥作為代謝綜合征成分也會影響炎癥。同時也發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗與肥胖之間也存在聯(lián)系，其中脂肪組織在發(fā)展胰島素抵抗的機制中發(fā)揮重要作用。脂肪細胞產(chǎn)生的非酯化脂肪酸可通過底物競爭和受損的細胞內胰島素信號傳導來阻止碳水化合物的代謝。脂肪組織分泌的最常見的細胞因子是脂聯(lián)素，脂聯(lián)素具有顯著的胰島素增敏作用，因此脂肪組織的增加導致與胰島素抵抗和代謝綜合征相關的脂聯(lián)素水平的降低。脂肪組織還產(chǎn)生幾種炎癥因子，例如IL-6，IL-6刺激CRP的產(chǎn)生，這也可以加劇與肥胖有關的炎癥，繼而導致肥胖相關的胰島素抵抗[22-23]。與已有研究結果一致，本實驗得出高脂高糖飲食的代謝綜合征小鼠表現(xiàn)出一系列的代謝紊亂，包括空腹血糖和空腹胰島素水平均顯著增加，血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP水平的增加，導致小鼠肥胖出現(xiàn)系統(tǒng)性低水平炎癥進而引起血糖-胰島素穩(wěn)態(tài)失衡，經(jīng)乳酸片球菌AS185干預后，機體低水平炎癥有所改善，同時胰島素抵抗指數(shù)顯著下降。

AMPK是哺乳動物細胞能量代謝的重要調節(jié)因子?；罨腁MPK刺激ATP產(chǎn)生的分解代謝途徑，如脂肪酸β氧化，并抑制ATP消耗過程，如脂肪生成[21-22]。AMPK的磷酸化依賴于上游LKB1的激活。LKB1是一種能夠磷酸化AMPK的上游激酶，是細胞對低能量反應的關鍵介質[23]。本研究的結果表明，AS185可能通過LKB1特異性siRNA刺激LKB1磷酸化，并清除LKB1，明顯阻斷了AS185處理肝細胞的AMPK和ACC磷酸化，通過促進新生脂肪的形成和脂肪酸氧化，可改善高糖高脂飲食誘導的代謝綜合征。AMPK的第一個下游酶靶點是ACC，它參與丙二酰輔酶A的合成。AMPK通過磷酸化ACC在Ser77和Ser79上抑制ACC活性，從而刺激脂肪酸氧化和降低脂肪酸合成[24]。此外，乳酸片球菌AS185對SREBP-1c的成熟有抑制作用。SREBP-1c是一種重要的成脂轉錄因子，在哺乳動物肝臟中含量豐富。由于SREBP-1c的過度表達，脂肪酸進入肝細胞會誘導新的成脂過程[25]。成熟后，SREBP-1c轉移到細胞核中，轉錄上調SCD-1和FAS表達，這是肝細胞從頭合成脂肪酸和TG所需的關鍵酶[26]。本實驗發(fā)現(xiàn)AS185組TC和FFA的產(chǎn)生減少可能是SREBP-1水平降低所致，這與以往的研究結果[27]一致。因此，本研究結果表明，乳酸片球菌AS185的補充是通過AMPK途徑介導ACC磷酸化和抑制SREBP-1信號來達到降脂的作用。

本實驗結果表明乳酸片球菌AS185不僅通過調節(jié)脂類代謝通路，而且通過在肝水平限制TLR4和MyD88的轉錄和表達的增加，抑制NF-κB活化，從而減少代謝綜合征引起的炎癥及其介質。Wang Yuhua等[28]報道，鼠李糖乳桿菌LGG通過抑制TLR4和TLR5以及抑制NF-κB活化和減少TNF-α生成，增加酒精性肝炎癥的保護作用。而Jung等[29]的研究表明L.sakeiK040706通過激活巨噬細胞中的TLR2-NF-κB途徑產(chǎn)生NO、TNF-α和IL-6，且與TLR4無相互作用。L.paracasei通過誘導NF-κB信號通路的負性調節(jié)因子，以TLR2-IRAK4依賴的方式抑制單核細胞頂體產(chǎn)生促炎性細胞因子[30]。另外，Raso等[31]指出L.paracaseiB21060在TLR2和TLR4表達上的活性相同，共享導致NF-κB活化的相同信號級聯(lián)。因此，益生菌可能通過誘導TLR2、TLR4等多種TLRs受體途徑調控高糖高脂飲食誘導的代謝綜合征中發(fā)揮作用，乳酸片球菌AS185改善代謝綜合征引起的炎癥反應的準確機制還有待于進一步證實。

綜上所述，乳酸片球菌AS185通過MyD88依賴的TLR4/NF-κB通路抑制了促炎癥細胞因子的表達，并依賴AMPK通路提升了LKB1、AMPK和ACC蛋白表達的脂代謝通路，改善了高糖高脂飲食誘導的代謝綜合征。