水產動物保活運輸中環境脅迫應激及生理調控機制的研究進展

謝 晶，王 琪

（上海海洋大學食品學院，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

隨著人們對鮮活水產動物的需求日益增大，其運輸量也越來越大。保活運輸是保證水產動物鮮活出售的重要方法，但在保活運輸過程中水產動物易受環境影響導致機體產生不適，因此，對于保活運輸最大的挑戰是減小外界環境脅迫因素所引起的水產動物應激反應。環境脅迫會影響水產動物正常的生理狀態，水產動物因機體耗能過多而處于疲勞狀態，會使其品質和食用口感下降[1]，且持續的高強度環境脅迫可能會直接使水產動物死亡，從而導致經濟損失。近年來，研究人員一直致力于研究水產動物保活運輸過程中的應激反應及產生機制，以及應激反應對其免疫系統的影響，進而采取行之有效的應激安撫方案[2-3]。因此，本文通過分析水產動物保活運輸過程中不同脅迫因素交互影響所引起的水產動物應激程度及生理和健康情況的變化，為緩解保活運輸中水產動物脅迫應激反應、探究有效的應激安撫方案、提高水產動物運輸存活率等相關研究提供參考。

1 環境脅迫因素

環境脅迫應激是外部環境對水產動物所處生存狀態產生的壓力，它使水產動物機體內的器官和組織產生應答機制：響應環境脅迫的變化并使水產動物正常的生理機能發生紊亂，從而產生應激反應[4]。水產動物在保活運輸過程中易受到外界環境的影響而引發機體不同程度的損傷，隨著脅迫程度的加深會使水產動物機體耗能過多，從而導致其免疫系統受到抑制。由于個體之間存在差異性，部分水產動物可通過自身調節環境脅迫所引起的應激反應再次實現體內新陳代謝平衡，而對于體質較弱的群體，若脅迫強度超過水產動物機體本身可調控的閾值，則會導致水產動物新陳代謝失衡，生理狀態紊亂，最終機體發生死亡[5]。水產動物保活運輸中的環境脅迫因素大致可以分為以下幾個方面：組織缺氧脅迫、酸堿及氨氮脅迫、鹽濃度及溫度脅迫、密度脅迫、機械損傷脅迫。

1.1 組織缺氧脅迫

在水產動物長距離保活運輸過程中需要提供充足的氧氣，否則供氧不足會引起組織缺氧脅迫應激。該脅迫會影響水產動物很多重要的生理和生化過程，導致水產動物組織形態結構、耗氧率、呼吸代謝、個體行為以及免疫應答等多方面發生改變，影響機體各個系統發揮正常功能[6-7]。水產動物在保活運輸中若長期暴露于缺氧脅迫環境中會加速其肝臟的氧化應激且嚴重損害其免疫系統，甚至可能會直接造成水產動物死亡[8-9]。王曉雯等[10]發現低氧脅迫影響了西伯利亞鱘幼魚肝臟、肌肉的抗氧化應激及能量代謝相關酶的活力，抑制了其免疫機能和抗病能力，且死亡率隨著低氧脅迫強度的增大而升高。胡利雙[11]測定鰱魚經不同時間自發呼吸低氧脅迫后生理生化指標和組織氧化應激指標，發現組織缺氧脅迫會引起鰱魚機體組織生理功能發生障礙，引發氧化應激反應，嚴重時會直接造成其組織器官的不可逆損傷甚至導致鰱魚死亡。Li Mengxiao等[12]在羅非魚對于組織缺氧脅迫的代謝適應機制中，發現其體內的碳水化合物可緩解短期組織缺氧脅迫所帶來的應激反應，而脂質對于長期組織缺氧脅迫所引起的應激有一定的緩解作用。因此，在水產動物保活運輸前，可適當喂養碳水化合物和脂肪含量較高的魚餌，以減緩外界環境改變所引起的應激反應。

1.2 酸堿及氨氮脅迫

pH值、氨氮含量是衡量水質好壞的重要指標，在保活運輸過程中異常的pH值和氨氮含量會對水產動物的生理狀況及抗病能力有顯著影響[13]。氨對水產動物有毒，大部分水產動物雖然對氨有一定的耐受性[14]，但是隨著氨氮脅迫時間的延長和強度的增加，過高或過低pH值的水環境都會影響水產動物的能量代謝、免疫指標、組織器官以及存活率等。

氨氮是水產動物保活運輸中最有毒性的主要污染物質，水產動物自身的代謝物質以及體表的黏液則是水體中氨氮的主要來源[15]。氨氮以非離子氨的形式進入血液，使血液中紅細胞攜氧能力下降從而造成機體組織缺氧[16]，氨氮還通過侵襲鰓表皮黏膜細胞、腸黏膜細胞和神經內分泌系統，破壞水產動物的肝腎功能并導致其內臟充血，嚴重時可以造成水產動物死亡和昏迷[17]。封琦等[18]研究氨氮脅迫對中華鳑鲏的毒性效應，結果表明中華鳑鲏在短時間內對高濃度氨氮具有一定的耐受性，但是氨氮脅迫時間的延長會使其免疫系統逐漸受到抑制。唐首杰[19]、徐楊[20]等對‘新吉富’羅非魚也做了相關研究，結果表明其幼魚在氨氮脅迫前期也具有一定的耐受性，隨著氨氮濃度增加并超出機體組織所能耐受的閾值后，高濃度氨氮對其血液生理生化以及肝臟的酶活力有顯著影響，并且其抗應激能力和免疫系統逐漸受到抑制。

不同種類的水產動物都有其適宜生長的最佳pH值，超過這個范圍會發生酸中毒或者堿中毒，甚至會導致水產動物死亡。pH值過低會使魚蟹鰓部受到腐蝕，導致機體呼吸代謝紊亂，且隨著血液酸性的增強會導致水產品發生酸中毒反應。通常酸性水體的特點是水中的溶氧量正常，但魚的行為表現為缺氧引起的浮在水面。Goss等[21]發現魚類在酸性環境條件下電解質遭到破壞，魚體血液中Na+濃度嚴重低于正常水平，同時會影響紅細胞的載氧能力以及免疫能力、吞噬細胞和肝組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活力。pH值升高也會對水產動物造成不同程度的損傷，同時由于機體呼吸代謝導致水體中氨氮不斷累積，pH值與氨氮脅迫交互影響，使氨氮毒性增強，此過程循環往復，致使水產動物腮腎組織與肝胰臟組織受損，呼吸困難，最終導致水產動物氨中毒，甚至出現死亡。因此，在水產動物保活運輸過程中應實時監測水中的氨氮比和pH值，實時優化水質是保證水產動物運輸存活率的關鍵。

1.3 鹽濃度及溫度脅迫

在水產動物保活運輸過程中，溫度和鹽濃度是誘發運輸應激的主要應激源。由于不同水產動物之間具有差異性，都有其各自最適宜的生存溫度和鹽濃度，過高或過低的溫度、鹽濃度會引發魚體應激反應和一系列的生理變化，影響水產動物代謝反應速率、使體內環境失衡、免疫功能和抗損傷能力下降甚至出現死亡。一般通過測定魚體血清中皮質醇、血糖含量變化來評價魚體發生應激反應的程度，進而評價魚類生理的健康狀況[22]。

溫度脅迫分為高溫脅迫和低溫脅迫，當水產動物處于溫度脅迫前期時，機體為抵御脅迫應激而釋放激素，若溫度脅迫程度較低，此時機體對脅迫可能會表現出一定的適應性，但脅迫溫度若與水產動物適宜的生存溫度相差較大，隨脅迫時間的延長水產動物呼吸代謝系統則會紊亂，其免疫系統受到抑制，嚴重時可導致死亡。李慶昌等[23]發現大黃魚在33 ℃高溫脅迫下有較強烈的應激反應，且其體內皮質醇、血糖和乳酸含量顯著升高，在高溫脅迫中機體逐漸出現死亡現象。管敏等[24]發現在低溫脅迫下史氏鱘幼魚的抗氧化指標、免疫指標和肝臟機能都受到不同程度的影響，表明低溫脅迫抑制其抗氧化防御系統和免疫系統發揮正常功能。

吳波等[22]研究了溫度和鹽相對含量兩個因素對石斑魚有水保活運輸應激的影響，表明過低鹽相對含量（5‰）和過高鹽相對含量（40‰）均會誘發石斑魚產生劇烈的應激反應，發現在溫度為15 ℃時，鹽相對含量為10‰～20‰條件下有水保活運輸石斑魚存活率最高。目前有研究發現鯉魚在質量濃度9 g/L NaCl的有水保活運輸中存活率明顯升高[25]，但是Gomes等[26]研究發現增加巨舌滑魚幼魚在運輸時水體中的鹽濃度，不僅沒有緩解應激反應而且會引起其幼魚的滲透壓失衡，當鹽濃度超過一定范圍時，魚類的耗氧量明顯增加。由于大多數水產動物生活的水環境與自身體液滲透壓不等，所以維持其體內的滲透調節非常重要，可以通過維持體內的水分與鹽濃度平衡達到機體體液平衡的穩態。水產動物內的滲透調節失衡可引起機體功能的紊亂甚至死亡[27]。因此，淡水魚在有水保活運輸中可以根據實際運輸情況適當增加水體的鹽濃度，且隨著運輸時間的延長水中的溶氧量會不斷減少，可適當采取降溫、曝氣等措施[28]。目前，對于水產品有水保活運輸中溫度或鹽濃度的單因素實驗已有大量研究，但溫度和鹽濃度兩個因素對水產品交互影響的研究相對較少。

1.4 密度脅迫

適宜的運輸密度既可以保證運輸質量又可以降低運輸成本，雖然高密度運輸可以提高水體的利用率，但會加快氧氣的消耗和二氧化碳的生成，且在保活運輸過程中由于個體擁擠碰撞會造成機體損傷，而引起的水產生物應激反應會影響其生理狀況和免疫防御功能，使其不能維持正常的生理狀態[29]。熊梅等[30]在水溫（17.0±0.5）℃下，研究密度脅迫對草魚的影響，檢測血清皮質醇水平、肌肉質構特性以及NRF2、HSP70和UPS相關基因的表達，發現密度脅迫使草魚產生明顯的應激反應，對草魚肌肉質構產生了顯著影響，同時提高了其肌肉泛素-蛋白酶體系統的活性。殷述亭等[31]通過觀察大菱鲆在密度脅迫下免疫效果和應激指標的變化規律，發現5 kg/m3為最佳密度。張偉等[32]研究大黃魚運輸的適宜條件是運輸密度不超過8 kg/m3、鹽相對含量為5‰。胡培培等[33]發現密度脅迫影響鲌翹嘴苗種生化和理化指標，運輸時間為10 h時最適運輸密度為47～54 kg/m3。由于不同水產動物之間存在個體差異性，因此針對不同種類的水產動物研究其最適宜的運輸密度是很有必要的。目前關于密度脅迫的研究主要集中在對水產動物血液生理生化、生理代謝和免疫系統等方面的影響[34]。而對于密度脅迫中水產動物能量代謝的生理調控機制以及導致免疫力降低的具體原因還有待進一步研究。

1.5 機械損傷脅迫

水產動物在保活運輸中的機械損傷脅迫應激包括搬運、噪音、振動以及運輸過程中個體之間相互碰撞導致機體產生的一系列脅迫反應。如在魚類保活運輸過程中由于鱗片和黏液的物理磨損可能會降低魚對環境脅迫的耐受力、免疫性能和抗疾病能力，從而降低水產動物的品質和運輸存活率。一般通過機體內血液生理生化指標的變化來評定水產動物保活運輸中機械損傷脅迫所帶來的影響[15,35]。Zhang Yonggang等[36]發現捕撈脅迫會對紅鯽魚的新陳代謝和免疫等機能造成影響，脅迫時間越長、強度越大，對其機能抑制越大。王文博等[37]在虹鱒魚的搬運、振動以及噪音中，發現外力脅迫抑制了虹鱒魚體內肝臟糖原和脂類的合成，而溶菌酶變化波動較小，這種現象可能與分泌或合成的機制不同有關。張宇雷等[38]探索了振動脅迫對斑石鯛的適應性，結果發現其皮質醇和腎上腺素含量明顯上升，而機體內肌糖原和肝糖原含量無顯著性變化，這表明短時振動脅迫所引起的機體應激反應較小，但是持續且高強度的振動脅迫則會引起斑石鯛神經興奮并產生應激反應。因此，為減緩機械損傷脅迫所造成的應激反應，確定適宜的運輸密度、優化保活運輸設備極其重要。

2 環境脅迫誘導的生理調控機制

Piekering[39]把魚類對環境脅迫所引起應激反應的適應性分為三級：一級反應為魚體內釋放激素之后機體作出不同程度的反應，包括血清皮質醇水平的變化（如皮質醇和腎上腺素上升），屬神經內分泌反應；二級反應是由于神經內分泌反應引起的蛋白質表達變化，如熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）、呼吸系統、能量代謝及水鹽平衡等血液生理生化參數和免疫調節的變化[40]；三級反應是在二級反應的基礎上機體逐漸適應脅迫應激，或發生輕度應激反應后即完成保活運輸，此時機體通過自身調節其各項生理指標逐漸恢復正常，或隨著脅迫持續時間的延長魚類出現行為變化、代謝系統紊亂、抗病力和免疫能力降低等反應[41]。水產動物保活運輸中的環境應激反應機制十分復雜，一般機體通過神經-內分泌途徑抵御環境脅迫導致的不利影響從而維持機體的穩態；水產動物的應激反應主要涉及體內神經內分泌、代謝和免疫等系統的調節，量化評價應激程度的指標主要有神經內分泌系統與血液生理生化指標、免疫系統與應激蛋白、細胞凋亡與組織損傷。

2.1 神經內分泌系統與血液生理生化指標

2.1.1 神經內分泌系統

水產動物在環境脅迫應激狀態下機體的穩態需要內分泌系統與神經系統的協同調節實現，神經內分泌系統在生物的代謝和生長等過程中起重要的調節作用[42]。當受到外界刺激時不同器官中的巨噬細胞和粒細胞被激活，做出防御反應[43]。神經內分泌系統與環境脅迫強度存在緊密的聯系，水產動物在受到外界刺激后，嗜鉻細胞迅速分泌兒茶酚胺，通過下丘腦-垂體-腎間組織軸大量分泌皮質醇，使血液中皮質醇含量升高，在這些神經激素的刺激下，心率、鰓呼吸速率都會加快[44]。但是長期處于高水平皮質醇狀態下則會使水產動物的免疫系統無法發揮正常功能，抗病能力大大降低。Hoglund等[45]發現魚類在應激脅迫條件下皮質醇水平升高、生理系統紊亂、代謝系統失調、免疫系統受到抑制。Vargas-Chacoff等[40]通過分析鮭魚的肝臟和肌肉指標，探究了脅迫應激對鮭魚神經內分泌系統的影響，發現體內糖皮質激素水平在脅迫后迅速上調，機體免疫組織受損。而Pickering[46]認為皮質醇的分泌能夠發生一些生理效應，如促進糖原合成和脂肪降解，且在此生理效應中伴有能量的生成，從而供給機體為抵御外界環境改變帶來脅迫應激的能量消耗。研究水產動物神經內分泌的免疫調節機制有助于預防和治療水產動物在養殖和運輸中由于環境脅迫所引起的疾病。

2.1.2 血液生理生化指標

血液生理生化指標可直接反映出水產動物的應激程度。血液生化指標主要包括血液激素水平、血清中酶含量和代謝產物[47]。水產動物在發生應激反應時，機體內的激素含量常被用作評價魚的生理指標[48]，血液中的腎上腺糖皮質激素和皮質醇含量會升高，其中血液皮質醇具有高穩定性，是反映其應激程度的靈敏指標。本文主要綜述皮質醇、腎上腺素和血糖對機體的影響。

Simia等[49]發現持續低溫脅迫會導致鱸魚機體內激素含量升高，影響其生理性能和免疫系統，若長期處于這種環境脅迫條件下，會引起機體代謝紊亂、滲透調節失衡、免疫系統不能發揮正常功能。Hossein等[50]研究了高密度放養脅迫下對鯉魚生理狀況的影響，在急性應激7 d后發現鯉魚皮質醇水平較高，且血糖水平較低。但Fabio等[51]發現隨著環境脅迫應激程度的增強，皮質醇水平和血糖濃度會不斷升高，且與脅迫強度呈正相關。徐鋼春等[52]對長江刀鱭幼魚也做了相關研究，發現隨脅迫程度的增強，血漿皮質醇水平和血糖濃度都不斷升高，肝糖原的變化規律與血糖濃度相對應。血糖作為評價水產動物應激程度的一項輔助指標，也可從側面反映其應激程度。雖然短時間應激所引起的體內激素含量升高不會造成機體生理狀態紊亂，并且還可以適當地提高水產動物對環境應激的適應性，但是隨著環境脅迫程度的加強和脅迫持續時間的延長，水產動物體內血液的激素水平會一直處于高水平狀態，此時會引起水產動物免疫能力和抗病能力減弱等負面作用。

2.2 免疫系統與應激蛋白

2.2.1 免疫系統

在多種環境脅迫因子交互作用下的脅迫初期，水產動物自身體內某些組織和器官的功能會發生相應的調整，使機體在脅迫中維持平衡狀態，但隨脅迫強度的增大會抑制其免疫功能[53]。免疫應答機制是一個復雜又有規律的生理過程，水產動物由于環境脅迫所引起的應激反應而發生的機體免疫一般為非特異性免疫，這種應激可能會導致水產動物免疫應答功能下降[54]。已有研究表明，將皮質醇注射到魚體內會導致其體內組織和器官或者血液中的T、B淋巴細胞數量顯著降低，但T、B淋巴細胞對皮質醇的敏感度存在一定的差異[55]。血液中一些酶類的變化也可以從某種程度上反映生理功能及免疫系統的變化，從而可作為判斷應激程度的指標。溶菌酶也是生物體中重要的免疫因子，可以水解細菌細胞壁從而使細菌死亡，還可以增強或協同其他免疫因子共同抵御外來病菌[56]；水產動物在環境脅迫中導致血液激素水平升高[57]，而溶菌酶活力可能會增強或減弱。Hossein等[50]發現鯉魚在高密度環境下脅迫7 d后其溶菌酶活力大大降低。還有研究表明，白細胞數目在一定程度上也決定了生物能否防御由細菌產生的疾病[58]。水產動物在脅迫應激下其免疫能力和抗病能力逐漸衰退，因此，免疫學指標的研究對于脅迫后水產動物生理狀態的自身恢復和安撫發揮重要的作用。

2.2.2 應激蛋白

應激蛋白即HSPs，是當發生應激反應時水產動物機體誘導產生的具有保護細胞免受機體組織和器官受損的一類蛋白質，可作為分子生態毒理研究中的生物標志物，目前研究最為深入的是HSP70。應激蛋白具有高度的保守性，主要存在于細胞質中，在蛋白代謝過程中起到重要的調節作用。HSPs合成量在應激狀態下明顯升高，此時正常蛋白質的合成則會受到抑制[59]。HSP70參與保護和修復從而減少應激反應導致的蛋白質變性，維持機體細胞內的穩態，而且HSP70還可以誘導SOD和過氧化氫酶（catalase，CAT）活力增加，減少對細胞的損害[60]。Chadwick等[61]發現溪鱒在脅迫中腮中的HSP70含量隨溫度的升高而升高，HSP70含量在22 ℃和24 ℃時分別比16 ℃時提高11 倍和56 倍，同時誘導細胞和內分泌的應激反應。Tedeschi等[62]研究了溫度脅迫對龜HSP70和HSP90表達情況的影響，發現在應激響應下其體內心臟組織和腦組織中的HSP70和HSP90基因表達量顯著增加。也有研究表明，饑餓和缺氧條件下也會使HSP70基因表達量增加[63]。HSP90作為細胞骨架和激素受體的構成成分，可以與凋亡蛋白相互作用，參與細胞周期和信號傳遞等重要過程。HSPs不僅可以作為水產動物應激反應的檢測指標，而且在細胞凋亡信號中發揮重要的作用。

2.3 細胞凋亡與組織損傷

細胞凋亡又稱程序性死亡，是當生物處于不利環境時，機體本身通過細胞代謝調節達到維持自身穩態的一種生物現象[64]。適當應激引起的部分細胞凋亡有助于水產動物細胞再生，增強機體抵抗力，但持續且多種脅迫交互影響所引起的應激反應會導致細胞凋亡程度加劇，使水產動物機體組織引發不同程度的損傷，且這種損傷短時間內不可修復。目前有研究發現在25 ℃時，水產動物血細胞中的活細胞數量顯著降低，并且出現肝臟組織受損，細胞變性、壞死和凋亡的現象[65]。Sun Junlong等[66]研究了高溫和缺氧脅迫交互作用對大嘴鱸魚肝臟的影響，發現肝臟中SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶活力增加、丙二醛含量增加，表明在交互影響下氧化應激加劇，免疫系統無法發揮正常功能，同時肝細胞出現凋亡現象，肝臟組織受損。谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）是兩種重要的轉氨酶，它們主要存在于肝臟中。當肝細胞受損時，ALT和AST會被釋放到血液中，因此血清中ALT和AST的活力增強是肝功能損傷最具特異性和廣泛使用的指標[67]。張玉晗等[68]在低溫休眠預處理對鱸魚保活效果的研究中發現，丙二醛含量、ALT和AST活力顯著升高，表明不同降溫速率均會對花鱸魚肝臟組織造成不同程度的損傷，且這種損傷在短時間內無法恢復。王琨[69]研究了氨氮脅迫對鯉幼魚機體組織和血液生理生化的影響，發現血清中ALT和堿性磷酸酶活力出現不同程度的升高，暴露第14天時SOD的活力顯著升高，之后酶活力逐漸受到抑制；暴露在不同濃度下的鯉魚肝腎組織、鰓組織以及內臟器官都受到了不同程度的損傷，腸黏膜上皮細胞出現變性和壞死，機體抗損傷能力和免疫機能下降。區又君等[70]以卵形鯧鲹為實驗對象也做了相關研究，結果表明低溫脅迫造成了卵形鯧鲹腮、腎、心臟和肝臟的損傷和免疫力下降。張玉晗等[71]通過使用保護液（質量分數0.09%溶菌酶+0.3%山梨糖醇+0.08%姜液）在花鱸魚的無水保活運輸中可將運輸存活率提升1%～5%，同時發現浸過保護液后再進行無水保活運輸可有效降低鱸魚腮腎組織損傷，且明顯提高其新陳代謝速率和機體免疫力。

3 結 語

導致水產動物產生應激反應的環境脅迫因素有多種，不同種類、不同程度、不同持續時間的脅迫可能會給水產動物帶來不同時程度的應激反應和機體損傷，但目前基于多種環境脅迫因子交互作用下的代謝特性變化規律以及水產品脅迫后的生理調控機制和安撫的研究相對較少。同時，在水產動物保活運輸中，也需要注重改善運輸環境；此外，還應該開發針對不同種類水產品的皮質醇受體阻斷劑以及抗應激免疫增強劑，在確保水產動物減少應激危害、增強機體免疫性能和降低發病率的同時，更要注重添加物在水產動物體內的無殘留研究，保證其從池塘到餐桌過程中的品質與安全。