羅伊氏菌素與兒茶素協同對變異鏈球菌的抑制作用

王思彤，張 彤，金 曼，曲國強，孫雪婷，付恒芳，劉麗波,*，李 春

（1.東北農業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學研究院，黑龍江 哈爾濱 150028；3.國家乳制品質量監(jiān)督檢驗中心理化室，黑龍江 哈爾濱 150028）

變異鏈球菌在牙齒表面形成生物膜是其致齲的基本特征，牙齒生物膜是自然界中最復雜的生物膜系統之一[1]。變異鏈球菌通過代謝蔗糖合成胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS），EPS對于凝集黏附菌體細胞于牙齒表面至關重要[2]，高含量的EPS也有利于提高生物膜的穩(wěn)定性和結構完整性，并為致病菌提供保護，使其免受抗菌劑和其他不良環(huán)境攻擊的影響[3]。此外，變異鏈球菌分解糖類物質產有機酸，酸性環(huán)境更有利于耐酸菌株變異鏈球菌發(fā)揮生長優(yōu)勢并侵蝕牙齒，進一步促進齲齒形成[4-5]。

茶多酚是綠茶中主要活性物質，而兒茶素類物質占茶多酚總量60%～80%[6]，研究表明其具有抗癌[7]、抗氧化[8]等優(yōu)良特性。兒茶素類物質能抑制口腔中致齲細菌生長和繁殖[9-10]，且對牙周炎具有良好的預防作用[11]。羅伊氏菌素是由羅伊氏乳桿菌在厭氧條件下發(fā)酵甘油產生的[12]，在水溶液中，羅伊氏菌素是一個動態(tài)系統，3-羥基丙醛（3-hydroxypropionaldehyde，3-HPA）最近被確定為該系統的主要抗菌成分[13]。據推測3-HPA可能通過與核糖核苷酸競爭結合位點或與不穩(wěn)定的巰基反應而抑制細菌DNA合成[14-15]。3-HPA在臨床中施用具有促進口腔健康的作用，能夠使口腔中變異鏈球菌的數量明顯減少[16]，Krasse等[17]以羅伊氏乳桿菌作為益生菌錠劑，對重度牙齦炎志愿者展開臨床實驗，結果觀察到志愿者炎癥減輕明顯，牙菌斑面積也大幅度減少。

抗菌藥物的應用和機械去除法是防治齲齒的主要傳統手段，但長期使用可能使細菌產生耐藥性，甚至引起菌群失調。目前，有許多基于天然植物成分[18-19]替代抗真菌藥的研究已用于預防齲齒以及促進口腔健康，也有研究發(fā)現天然多酚類物質與抗真菌藥相結合[20-21]具有協同效應，且能夠降低抗真菌藥的劑量。本研究為避免化學制劑和抗生素的使用，以及降低單組分的使用劑量和副作用，增強對變異鏈球菌生物膜的抑制作用，探究兒茶素與羅伊氏菌素的協同效應。為今后開發(fā)天然、安全、有益的防齲產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

變異鏈球菌ATCC25175購于中國微生物菌種保藏中心CGMCC；羅伊氏乳桿菌保藏于東北農業(yè)大學教育部乳品科學重點實驗室。

兒茶素 卡邁舒（上海）生物科技有限公司（純度＞98%）；細菌基礎培養(yǎng)基（DeMan-Rogosa-Sharpe medium，MRS）、腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

潔凈工作臺 力康精密科技（上海）有限公司；離心機 上海安亭科學儀器廠；酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；紫外分光光度計 上海圣科儀器設備有限公司；掃描電子顯微鏡 上海復納科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種保存與活化

將變異鏈球菌由標準菌株置于BHI液體培養(yǎng)基復蘇48 h，接著在厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，于BHI固體培養(yǎng)基劃線分離，鏡檢確定為純培養(yǎng)后，用體積分數50%的甘油保存菌株，置于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ。?0 ℃凍存的羅伊氏乳桿菌菌液，接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃活化培養(yǎng)傳代使用。

1.3.2 羅伊氏菌素的制備

通過兩步發(fā)酵法[22]獲得羅伊氏菌素用于實驗。首先，將羅伊氏乳桿菌在MRS培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)，37 ℃厭氧生長12 h，隨后1 500×g離心5 min收獲細胞并洗滌制備饑餓細胞，在洗滌過程中使用質量分數0.85% NaCl溶液洗滌2 次以確保沒有培養(yǎng)基殘留，饑餓時間約為1 h。然后，將洗滌后的細胞重懸浮于含有甘油的緩沖溶液中，37 ℃下培養(yǎng)2 h生產羅伊氏菌素。隨后將發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min，取上清液過濾除菌，－20 ℃保存?zhèn)溆谩⒄誏üthi-Peng等[23]的方法，測得粗提液3-HPA濃度為145 mmol/L。

1.3.3 最低抑菌濃度及最小殺菌濃度的測定

參照文獻[24]的方法并略作修改，在含有質量分數1%蔗糖BHI培養(yǎng)基中制備兒茶素和3-HPA的系列梯度儲備溶液。使用96 孔板進行微量測定，分別將100 μL每種濃度的兒茶素和3-HPA加入相應的孔中，接著每孔加入100 μL終濃度為105～106CFU/mL的菌懸液。使兒茶素的終質量濃度分別為8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg/mL，3-HPA的終濃度分別為32、16、8、4、2、1 mmol/L。使用陰性對照（沒有加入菌液）和陽性對照（沒有任何抑菌物質），在37 ℃下培養(yǎng)微孔板24 h后在酶標儀上測定OD600nm。觀察變異鏈球菌生長濃度無明顯變化的最小兒茶素和3-HPA濃度即為最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），通過對BHI固體培養(yǎng)基進行平板計數計算并確認最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。一式3 份進行測定，并進行3 次獨立實驗。

1.3.4 兒茶素和3-HPA對變異鏈球菌的聯合抑菌作用測定

采用棋盤稀釋法[25]評估兒茶素和3-HPA對變異鏈球菌的抑菌作用能力：根據兒茶素和3-HPA對變異鏈球菌的單獨使用時MIC，將2 種藥液分別依次對比稀釋，稀釋濃度分別為2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC。取50 μL兒茶素倍比稀釋液，分別加在96 孔板的第2～7列，取50 μL 3-HPA倍比稀釋液，分別加在96 孔板的第2～7行。接著每孔再加入100 μL變異鏈球菌懸液，使菌液終濃度為105～106CFU/mL，以不接種菌液或無抑菌物質的孔作為對照。微孔板37 ℃下培養(yǎng)24 h后測定OD600nm。沒有明顯生長的最低濃度被認為是MIC。根據單獨與聯合抑菌情況，按下式計算分級抑制濃度指數（fractional inhibitory concentration index，FICI），從而定量評價兩者的抗菌作用關系。

FICI＝（兒茶素聯合作用時MIC/兒茶素單獨作用時MIC）+（3-HPA聯合作用時MIC/3-HPA單獨時MIC）

當FICI≤0.5時表示協同作用，0.5＜FICI≤1時表示相加作用，1＜FICI≤2時表示無關作用，FICI＞2時表示拮抗作用。實驗一式3 份進行測定。

1.3.5 變異鏈球菌生物膜量的測定

參照Li Bingchun等[26]的方法，略作改動。在96 孔板中加入200 μL含有1%蔗糖的BHI培養(yǎng)基，并接種適宜濃度的變異鏈球菌菌液，37 ℃培養(yǎng)48 h后。小心地吸出浮游細菌，用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌平板上的生物膜。將200 μL稀釋到適宜濃度的兒茶素及3-HPA加入到96 孔中，設置空白對照組。繼續(xù)溫育5、30 min，6、12、24、48 h后，將96 孔板取出，小心地除去培養(yǎng)基，無菌PBS洗滌2 次，每孔添加200 μL體積分數95%甲醇溶液固定微量滴定板中的生物膜，室溫下放置20 min。除去甲醇并洗滌，接著向孔中加入0.1%結晶紫125 μL在室溫下溫育15 min。無菌PBS洗滌3 次，37 ℃干燥2 h后，每孔加200 μL 95%乙醇溶液，振蕩脫色15 min，以充分釋放結晶紫，手動混合孔中的內容物，最后每孔75 μL轉移到新的96 孔板中，并用分光光度計測定OD600nm。

1.3.6 EPS含量的測定

參照Goc等[27]方法，略作如下改動：向24 孔板中加入3 mL含有質量分數1%蔗糖的BHI培養(yǎng)基，接種2%菌液，37 ℃下培養(yǎng)48 h以形成變異鏈球菌生物膜，除去浮游細菌，用無菌PBS洗滌生物膜2 次。接著用兒茶素及3-HPA處理生物膜5、30 min，6、12、24、48 h后吸出培養(yǎng)液，用細胞刮刀將生物膜刮下轉移到1.5 mL離心管中，用1 mL蒸餾水將生物膜重懸，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集上清液，重新懸浮生物膜沉淀，洗滌2 次，再次以6 000 r/min離心10 min，合并上清液，檢測水溶性多糖（water-soluble glucan，WSG）含量。水洗后的沉淀加1 mL 0.5 mol/L NaOH溶液洗滌，離心3 次，合并上清液，測定水不溶性多糖（water-insoluble glucan，WIG）含量。兩部分上清液各取l mL，分別加入3 mL無水乙醇，4 ℃冰箱放置過夜，離心，棄水相，沉淀分別加入1 mL蒸餾水、1 mL 0.l mol/L NaOH溶液溶解，用蒽酮法分別測定水溶性及水不溶性葡聚糖含量。

蒽酮法：取樣品1.0 mL，加蒽酮試劑3 mL，95 ℃水浴煮沸6 min，冷卻，測其625 nm波長處的吸光度，根據標準曲線及稀釋倍數計算樣品中多糖的含量。

1.3.7 產酸能力的測定

參考邵旭媛等[28]方法并略作改動。將兒茶素及3-HPA溶解于初始pH值為7.4的BHI培養(yǎng)基中。實驗組菌液與藥液按1∶10（V/V）接種變異鏈球菌，在37 ℃條件下分別溫育5、30 min以及6、12、24、48 h后，培養(yǎng)物經6 000 r/min離心5 min，取上清液，測定上清液的pH值，并計算培養(yǎng)前后pH值的變化值（ΔpH）。

1.3.8 掃描電子顯微鏡觀察生物膜結構

使用掃描電子顯微鏡觀察變異鏈球菌生物膜結構的改變[29]，在6 孔板中置入細胞爬片，每孔中分別加入3 mL單一兒茶素、3-HPA和協同濃度組并接入細菌培養(yǎng)液，對照組只接入菌液。37 ℃培養(yǎng)24 h，接著用戊二醛在4 ℃固定細胞2 h，PBS沖洗2 次，再分別用梯度體積分數（50%、70%、90%、100%）乙醇脫水，最后將樣品冷凍干燥，噴金鍍膜，掃描電子顯微鏡觀察。

1.4 數據統計分析

采用Origin 2018軟件作圖，運用SPSS Statistics 20軟件對數據進行處理分析，組間差異顯著性采用單因素方差分析進行比較（P＜0.05表示差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 兒茶素和3-HPA的MIC及MBC

經測定，兒茶素和3-HPA對變異鏈球菌的MIC分別為1 mg/mL及8 mmol/L，MBC分別為2 mg/mL及10 mmol/L。

2.2 兒茶素和3-HPA對變異鏈球菌的協同作用

如表1所示，兒茶素對變異鏈球菌單獨用時MIC為1 mg/mL，3-HPA單獨使用時MIC為8 mmol/L。計算各標記（－）的聯合使用的FICI，選取最優(yōu)聯用組合。表中標記（－）*處顯示兒茶素的MIC為0.125 mg/mL，3-HPA的MIC為2 mmol/L。兩抑菌物質聯用時MIC明顯低于單獨使用時MIC，將得到的MIC代入FICI公式，計算并進行判斷：FICI＝0.125/1+2/8＝0.375＜0.5，表明兒茶素和3-HPA具有協同作用，因此采用（－）*處質量濃度組合進行后續(xù)實驗。

表1 兒茶素和3-HPA對變異鏈球菌聯合藥敏實驗結果Table 1 Inhibitory effect of catechin combined with 3-HPA against S.mutans

2.3 變異鏈球菌生物膜量的測定結果

蔗糖可影響齲齒的生物膜特性，培養(yǎng)基中添加1%～5%的蔗糖可提高變異鏈球菌生物膜積累量和生物膜結構的穩(wěn)定性，由此可能增加其致齲的風險[30]。本實驗采用質量分數1%蔗糖的BHI培養(yǎng)基來進行生物膜測定實驗。在變異鏈球菌成熟生物膜上測試了3 組抑菌物質的抑菌作用效果。圖1為單一兒茶素（MIC）或3-HPA（MIC）以及它們協同使用（兒茶素（1/8 MIC）+3-HPA（1/4 MIC））時對不同處理時間變異鏈球菌生物膜生成量的影響。6 h時僅3-HPA單獨作用和協同作用顯示出對目標菌株的抑制作用。在培養(yǎng)12、24 h及48 h時兒茶素或3-HPA單獨及聯合使用都顯示出對變異鏈球菌生物膜顯著的抑制作用，僅用MIC兒茶素處理時生物膜量降低了19%、23.8%和21.4%，而協同組合降低了27.4%、33.5%和34.3%生物膜的量（P＜0.05），這與Gabe等[31]研究沒食子酸辛酯對變形鏈球菌生物膜形成結果相似。而短時間10 min及30 min處理未見有顯著抑制作用（P＞0.05）。

圖1 兒茶素和3-HPA單用及其聯合使用對變異鏈球菌生物膜的影響Fig.1 Effect of catechin and/or 3-HPA on S. mutans biofilm

2.4 EPS含量的測定結果

圖2 兒茶素和3-HPA單用及其聯合使用對變異鏈球菌WSG（A）和WIG（B）的影響Fig.2 Effect of catechin and/or 3-HPA on contents of water-soluble glucan (A) and water-insoluble glucan (B) in S.mutans

變異鏈球菌利用蔗糖分泌兩種EPS，WSG被釋放到培養(yǎng)上清液中為細菌提供能量，WIG黏附在牙齒表面并參與菌斑基質的形成，EPS含量是衡量變異鏈球菌致齲性能的重要指標[32]。如圖2A所示，WSG在6～12 h時分泌能力最強，其含量顯著增加，這與早期生物膜形成需要大量的能源物質與代謝底物有關[33]，之后在12～48 h時分泌量以基本穩(wěn)定的趨勢不斷提高。用3 組抑菌物質處理變異鏈球菌6 h后開始起到明顯的抑制作用，在處理24 h和48 h后，與對照組相比，協同組WSG分泌量分別顯著降低50.3%、45.2%，而單一兒茶素組WSG分泌量分別降低了27.8%、27.3%（P＜0.05）。短時處理10 min后，單一藥物處理組及協同組與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

如圖2B所示，對照組WIG在30 min～12 h時分泌量明顯增加，這與此階段需要大量WIG來維持生物膜結構的形成有關[34]，之后12～48 h WIG合成能力有所下降，分泌量增加趨勢趨于和緩平穩(wěn)。因此，抑菌物質主要在30 min～12 h時施用抑制作用最為明顯，這與黃曉晶等[35]發(fā)現的在不同時間段變異鏈球菌體外EPS合成能力不同的結論相似。3 組抑菌物質的WIG分泌量在30 min～48 h時與對照組相比差異顯著（P＜0.05），且在24～48 h時協同組WIG分泌量顯著低于兩個單一用藥組（P＜0.05），這一結果與2.3節(jié)3 組抑菌物質對變異鏈球菌生物膜量的抑制結果相似。而在短時處理10 min后各抑菌用藥組與對照組相比未見有統計學上差異（P＞0.05），這可能由于作用時間較短，單一兒茶素（MIC）或3-HPA（MIC）及協同組未對變異鏈球菌起到有效抑制作用。

2.5 產酸能力的測定結果

3 組抑菌物質處理不同時間后對變異鏈球菌產酸能力的影響如圖3所示，在6～48 h時3 組抑菌物質之間酸度變化均有顯著差異（P＜0.05），按照抑制產酸能力由大到小的順序排列為：協同組（兒茶素（1/8 MIC）+3-HPA（1/4 MIC））＞3-HPA（MIC）＞兒茶素（MIC）。0～6 h與0～12 h時協同組對上清液中酸度影響最為明顯，6、12 h時，協同組作用后pH值分別降低0.53±0.02、0.81±0.08，與對照組相比，協同組分別抑制了76%、73%有機酸的產生。這可能也與此階段抑制了WSG的分泌，從而減少了產酸途徑中代謝底物量有關。在處理30 min時，僅單一兒茶素（MIC）組與空白對照組之間ΔpH值無顯著性差異（P＞0.05），短時間處理10 min各組之間ΔpH值均無統計學上意義（P＞0.05），處理6～48 h時各抑制物質組與對照組相比均有顯著差異（P＜0.05）。

圖3 兒茶素和3-HPA單用及其聯合使用對變異鏈球菌產酸能力的影響Fig.3 Effect of catechin and/or 3-HPA on acid-producing capacity of S.mutans

2.6 生物膜結構的掃描電子顯微鏡觀察結果

圖4 為對照組和經3 組抑菌物質處理后變異鏈球菌的掃描電子顯微鏡圖，未經任何處理的變異鏈球菌菌體表面光滑呈短桿狀（圖4A1、B1），各個細體緊密相連，層層疊加，由密集的生物膜基質緊緊包裹圍繞，形成密集均勻的網狀結構，也因此其生物膜具有一定的厚度。而圖中致密生物膜基質的形成是由于菌株培養(yǎng)基中添加了1%的蔗糖，蔗糖被變異鏈球菌利用生成更多葡聚糖，增強菌體黏附力的同時增加生物膜胞外基質的量[36]。觀察經過3 組抑菌物質處理的電子顯微鏡圖，可發(fā)現變異鏈球菌菌體表面粗糙，有褶皺存在；菌體細胞數量明顯減少，菌落之間連接較為松散，生物膜結構出現明顯改變，生物膜胞外基質粗糙稀疏，網狀結構孔隙變大，出現不規(guī)則管道結構，生物膜厚度降低明顯（圖4）。

圖4 兒茶素和3-HPA單用及其聯合使用時的變異鏈球菌掃描電子顯微鏡圖像Fig.4 Scanning electron microscopic image of S. mutans treated and not treated with catechin and/or 3-HPA

3 討 論

本實驗通過二步發(fā)酵法，利用羅伊氏乳桿菌轉化甘油生產3-HPA粗提液。采用棋盤稀釋法分析得到當兒茶素（1/8 MIC）和3-HPA（1/4 MIC）聯合使用時其具有協同作用，因此采用此時的協同濃度組合與單一兒茶素（MIC）和3-HPA（MIC）相對比進行抑菌機理的探討。結果表明協同組抑菌效果優(yōu)于單一用藥組，協同處理能顯著減少變異鏈球菌生物膜的生成、降低膜外基質EPS的分泌、抑制產有機酸的能力，可看出其能夠有效抑制菌體在齒面的聚集與黏附，并參與底物代謝提高酸度，維持有益菌生存的口腔環(huán)境。3 組抑菌物質處理組的掃描電子顯微鏡圖也可看出菌體數量減少，生物膜結構改變，膜厚度降低，進一步驗證了兒茶素及3-HPA對變異鏈球菌的抑菌機理。Wasfi等[37]對乳酸桿菌發(fā)酵上清液抑制變異鏈球菌作用機理均得到類似結論。Yang Ning等[21]將表沒食子兒茶素沒食子酸酯與抗真菌藥協同作用口腔念珠菌，觀察發(fā)現處理組能夠顯著降低生物膜的生成量，且協同使用增強了抑菌效果，降低了抑菌藥物的劑量，本實驗得出的結論與其研究相似。本研究為安全、新型的抑齲產品的開發(fā)提供了理論依據。但值得注意的是，在實際應用于齲齒治療中，還應當考慮適宜的作用時間，形成便捷有效的預防措施。