含發酵乳桿菌HY01牦牛酸奶工藝優化及主體風味成分動態解析

于素素，楊佳杰，馬向陽，賈新棟，劉麗波，杜 鵬，李艾黎

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

牦牛酸乳是我國西南地區（如青海、四川、甘肅、西藏等）的傳統特色美食之一，其脂肪、蛋白質等營養成分的含量均高于普通市售酸奶[1]。除了營養特性優良，近年來不斷有新的研究證實牦牛酸乳還具有降低人體膽固醇、預防胃潰瘍、抗動脈粥樣硬化、提高骨密度、調節血糖、強化肌肉組織、增強免疫力、清除自由基等多種保健功能[2-5]，是純天然的益生食品。但目前牦牛發酵乳制品多以家庭式手工作坊為主，工業化生產能力比較薄弱[6]，如何提高產品附加值，轉變當前牧民主要銷售初級畜產品的現狀是亟待解決的問題。

以往研究多集中在優化傳統生產工藝，如陳一萌等[7]分析了不同穩定劑對凝固型牦牛酸奶在后酸化過程中品質及風味的影響；余闖闖等[8]以藏靈菇作為發酵劑生產新型牦牛酸奶；李升升等[9]結合標準化評估法研究了殺菌、接種量、發酵溫度及后酸化過程對牦牛酸奶品質的影響；胡凱麗等[10]比較了牦牛酸乳和市售酸乳發酵過程中酸度、質構和風味成分的變化規律。近年來，人們更加關注自然發酵牦牛酸乳中優勢乳酸菌的多樣性及其功能特性，如劉怡萱[11]和孫思雨[12]等運用高通量測序技術分析了西藏農牧區和川西地區牦牛酸奶中的細菌多樣性，并探究環境因素對其差異形成的影響。張麗[13]從青藏高原牦牛酸奶中篩選出具有免疫調節功能的Lactobacillus caseiG12和L. acidophilusE2；Zhao Xin等[14]從傳統牦牛酸奶中篩選出具緩解便秘作用的L. plantarumYS2，Ding Wurong[15]和Yu Qian[16]等從傳統牦牛酸奶中篩選出具有降膽固醇作用的L. plantarumLp3和L. caseiYBJ02。陳明等[17]從青藏高原牦牛酸奶中篩選出的L. plantarumXM5可有效緩解D-半乳糖對大鼠腦組織的氧化損傷。因此，后續需進一步加強益生菌的生產特性研究，促進牦牛乳資源的合理利用。本課題組前期從四川省紅原縣牧民自制牦牛酸乳中篩選出發酵乳桿菌HY01，其對結腸炎和便秘具有良好的預防效果[18-19]。以具有自主知識產權的益生菌為研究對象，首先利用單因素試驗、響應面試驗優化發酵含益生菌牦牛酸乳的工藝條件，進而利用電子鼻監控后熟過程中的揮發性風味物質變化，并觀察含益生菌牦牛酸奶在貯藏期間的品質變化。以上研究對于開發可應用于發酵牦牛乳且具有益生特性的乳酸菌，以及改善牦牛酸乳的品質具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛鮮奶由甘南牧場提供；鮮牛乳由完達山牧場提供；普通酸奶由本實驗室采用發酵劑MY105和發酵乳桿菌HY01對鮮牛乳進行發酵獲得；MRS培養基 北京索萊寶科技有限公司；發酵乳桿菌HY01由西南大學課題研發組提供；發酵劑MY105（含嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌） 丹尼斯克公司。

1.2 儀器與設備

SPL-150生化培養箱 天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；AlphaClean1300超凈工作臺 上海HealForce公司；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；THZ-D臺式恒溫振蕩器 蘇州市培英實驗設備有限公司；PB-10型pH計 北京杰諾康科技有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；JJ0.3/25均質機 廊坊市匯通機械廠；PEN3便攜式電子鼻（傳感器陣列見表1） 德國Airsense公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；Universal TA質構儀 上海騰拔儀器科技有限公司。

表1 電子鼻的傳感器陣列Table 1 Sensor arrays of electronic nose used in this study

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化與制備

將冷凍干燥保存的發酵乳桿菌HY01接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養18 h后3 000 r/min離心10 min收集菌體，再將菌液稀釋到106CFU/mL后接種于滅菌脫脂乳中37 ℃培養（108CFU/mL）至凝固，反復傳代3 次使菌種充分活化，即為工作發酵劑（108CFU/mL）使用。

1.3.2 牦牛酸奶制備工藝流程

牦牛乳（或鮮牛乳）→均質→殺菌→冷卻→添加發酵劑MY105、發酵乳桿菌HY01→發酵→冷卻→冷藏后熟→成品

1.3.3 酸奶制備工藝操作要點

均質：將牦牛乳（或鮮牛乳）用均質機在25 MPa的條件下均質1～2 次；殺菌：均質后的物料立即加熱至95 ℃，保溫5 min；冷卻：殺菌后的物料迅速冷卻至44 ℃左右；接種：在無菌條件下，加入MY105（106CFU/mL）復合既定比例的HY01；發酵：將接種好的物料混勻，于恒溫培養箱中發酵至凝乳形成；冷藏后熟：發酵結束后將產品移入4 ℃冷藏16 h。

1.3.4 指標檢測

酸度測定：參照GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》[20]采用滴定酸度法進行；雙乙酰和乙醛測定：采用碘滴定法[21]和鄰苯二胺比色法[22]進行；益生菌活菌數測定：采用平板計數法[23]進行。

質構測定：用P/PE反擠壓探頭測定牦牛酸奶質構。測量條件[24]如下：測前速率為1.0 mm/s，測試速率為1.0 mm/s，測后速率為2.0 mm/s，壓縮距離20 mm，2 次壓縮間隔為5 s，進行3 次重復實驗，測定的質構指標為硬度、稠度、內聚性和黏度。

感官評定：以色澤、組織狀態、滋味、氣味為感官評價指標。邀請10 名經過感官評價訓練的人進行評價，滿分為100 分，感官評分標準[25]見表2。

表2 牦牛酸奶感官評分標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of yak yogurt

1.3.5 牦牛酸奶發酵工藝單因素試驗

在發酵劑MY105添加量固定的條件下（106CFU/mL），依次改變發酵乳桿菌HY01接種量、發酵時間、發酵溫度，以牦牛酸奶的滴定酸度、pH值、活菌數和感官評價為考察指標。

1.3.5.1 HY01接種量的影響

于40 ℃發酵6 h條件下，考察在牦牛乳中接種2%、3%、4%、5%、6%發酵乳桿菌HY01（V/V）對菌數、酸度及感官評分的影響。

1.3.5.2 發酵溫度的影響

牦牛乳中接種3% HY01，在發酵6 h條件下，觀測不同溫度（34、36、38、40、42 ℃）對菌數、酸度及感官評分的影響。

1.3.5.3 發酵時間的影響

牦牛乳中接種3% HY01，在發酵溫度為38 ℃，測定不同發酵時間（4、5、6、7、8 h）菌數、酸度及感官評分的變化。

1.3.6 牦牛酸奶發酵工藝的響應面優化

以單因素試驗結果確定響應面試驗3因素3水平參數見表3，根據感官評價以及活菌數指標進行響應面分析，2 個指標各占權重50%[26]。

表3 響應面試驗因素與水平Table 3 Level and code of independent variables used for response surface analysis

1.3.7 電子鼻測定不同后熟時間牦牛酸奶的香氣組分

按照最優工藝發酵牦牛酸奶和普通酸奶，并按照不同時間（8、12、16、20、24 h）進行后熟。取20 mL樣品，注入到30 mL的上樣瓶中，瓶蓋封住瓶口在室溫下富集15 min后，采用頂空上樣法對樣品進行電子鼻檢測[27-28]。每組設置10 個平行。

1.3.8 牦牛酸奶貯存期理化指標測定

測定于4 ℃條件下貯藏28 d的牦牛酸奶的酸度、pH值、益生菌活菌數、質構特征（硬度、稠度、黏聚性、黏性指數）、雙乙酰和乙醛含量及感官評分，分析在整個貯藏期內上述指標的動態變化。每7 d測一次，每組設置3 個平行。

1.4 數據分析

采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析與顯著性差異分析，運用Origin 8.0軟件作圖，響應面結果用Design-Expert 8.0.5進行Box-Behnken分析。

2 結果與分析

2.1 益生菌牦牛酸奶發酵條件的單因素結果

發酵條件對益生菌生長及酸奶品質有較大影響。由圖1a可知，隨著HY01接種量增加，牦牛酸奶酸度逐漸增大，感官評分先增大后減小，益生菌數逐漸增多。當HY01接種量大于4%時，牦牛酸奶乳清析出較多，有尖酸味。當HY01接種量為4%時，益生菌活菌數達到2.4×108CFU/mL，滴定酸度102.40 °T，牦牛酸奶外觀光滑，氣味濃郁。同樣，秦楠等[29]發現益生菌接種量對酸奶的酸度，蛋白質質量分數以及抗氧化活性影響較大。曾麗萍等[30]發現當接種量為3%～4%時，成品酸奶中益生菌菌數可達到108CFU/mL，既具有良好的益生性能，產品感官評分也較高。

由圖1b可知，隨著發酵溫度升高，牦牛酸奶酸度逐漸增大，感官評分先增大后減小，活菌數逐漸增多。34～38 ℃低溫發酵使得乳酸菌的生長速率偏低，益生菌菌數較少（約107CFU/mL），牦牛酸奶發酵不完全，產品口感滋味和組織狀態較差。賈凌云[31]和馬昱陽[32]等研究也證實低溫不利于酸奶中的乳酸菌生長，導致感官品質較低。而40～42 ℃發酵時活菌數可達到2.08×108CFU/mL，滴定酸度105.70 °T，且酸乳的凝乳狀態、口感以及香氣均較好。

由圖1c可知，隨著發酵時間延長，牦牛酸奶酸度逐漸增大，感官評分先增大后減小，活菌數逐漸增多。發酵時間過短，發酵乳桿菌沒有充分發揮作用而導致牦牛酸奶感官評分較低。發酵至第6小時，牦牛酸奶感官評分較佳，滴定酸度達到102.6 °T，活菌數達3.56×108CFU/mL。若發酵時間過長則會影響產品品質及風味。同樣，冶成君等[33]發現發酵時間長短對凝固型酸奶的生產有影響，凝固型酸奶在第6小時活菌數達到9.6×108CFU/mL，此時酸奶的品質風味最佳。

圖1 發酵條件對牦牛酸奶品質的影響Fig. 1 Effect of fermentation conditions on the quality of yak yogurt

2.2 響應面試驗結果和方差分析

以發酵乳桿菌HY01接種量（A）、發酵時間（B）和發酵溫度（C）為自變因素，感官評分和活菌數為因變量，采用Design-Expert軟件對牦牛酸奶的發酵工藝參數進行優化（表4）。對實驗數據進行分析，得到二次多項回歸方程為：R1=89.75+1.60A+0.74B+0.40C-0.83AB+0.29AC+0.70BC-2.87A2-1.87B2-2.21C2；R2=87.98+2.09A+5.85B-1.46C+0.35AB-3.74AC+5.84BC-5.61A2-5.13B2-10.99C2。

由表5、6 可知，2 個模型均達到極顯著水平（P＜0.000 1），且失擬項不顯著（P＞0.05），說明兩模型擬合程度均較好，適用于牦牛酸奶工藝參數優化。A、B及AB、BC的交互作用及A2、B2、C2對牦牛酸奶感官評分的影響顯著（P＜0.05），C、AC則影響不顯著。A、B、C及AC、BC的交互作用及A2、B2、C2對益生菌菌數有顯著影響（P＜0.05），AB則影響不顯著。根據F值大小，各因素對牦牛酸奶感官評分影響順序為接種量＞時間＞溫度，對益生菌活菌數影響順序為時間＞接種量＞溫度。

表4 響應面試驗設計與結果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

表5 感官評分響應面擬合回歸方程的方差分析結果Table 5 Analysis of variance of quadratic polynomial model for sensory evaluation score

表6 益生菌活菌數響應面擬合回歸方程的方差分析結果Table 6 Analysis of variance of quadratic polynomial model for viable probiotic count

2.3 各因素間相互作用

圖2所選范圍內的極值既是響應面的最高點，同時也是等高線最小橢圓的中心點。由結果可知HY01接種量和發酵時間、發酵時間和發酵溫度對感官評分以及活菌數交互作用較強，說明該因素對益生菌牦牛酸奶品質影響較大。

圖2 不同因素交互作用對牦牛酸奶感官評分和活菌數的影響Fig. 2 Response surface and contour plots showing interactive effects of variables on sensory score and viable probiotic number in yak yogurt

2.4 最優工藝條件的預測及驗證

利用Design-Expert 8.0.5預測益生菌牦牛酸奶發酵最佳工藝條件為發酵溫度40.16 ℃、發酵時間6.28 h、HY01接種量4.23%，預測感官評分為90.02，活菌數為8.93×108CFU/mL。為便于實驗操作，對優化條件取整后得到發酵溫度為40 ℃，發酵時間為6 h，HY01接種量為4%。進一步的驗證實驗表明，響應面法優化牦牛酸奶的工藝參數可靠（表7）。

表7 最優水平條件下的預測值及實驗值Table 7 Predicted and experimental values under optimal fermentation conditions

2.5 含益生菌牦牛酸奶在貯藏期間品質變化

如圖3所示，貯藏期間酸奶酸度的變化較大，1～7 d存貯期，益生菌牦牛酸奶的酸度變化較小，14 d后出現較大幅度上升，這與李興等[34]觀察低聚乳糖酸奶和市售酸奶貯藏期間酸度升高的結果一致。活菌數目與貯藏溫度、酸度、營養物濃度等密切相關[35]。牦牛酸奶中的益生菌菌數在前14 d維持108CFU/mL，14 d后降低到107CFU/mL，但也達到益生菌數要求[36]。這與賈凌云等[31]觀察普通酸奶在1～21 d貯存期中活菌數的變化結果相似。可能的原因是，有機酸的增加抑制了菌的增長。

在0～14 d內，牦牛酸奶的硬度、稠度、黏聚性幾乎無變化、黏性增加，在14～28 d期間，牦牛酸奶的4 項質構指標逐漸下降。Feng Cuijiao等[37]發現山羊酸奶在貯藏14 d后，酸奶的4 項質構指標下降。Zhou等[38]表明，貯存期間酸奶黏性的增加可能與細菌分泌胞外多糖有關。劉寧寧等[39]發現在28 d貯藏期酸奶硬度下降，這可能與酸奶穩定性減弱，酪蛋白凝膠聚集結構不穩定，乳清析出有關。

本研究發現含益生菌牦牛酸奶的乙醛和雙乙酰含量遠高于以往文獻中市售酸奶香氣成分的平均值（雙乙酰約21 mg/L，乙醛約8.5 mg/L）[40]，且在第7天時達到峰值（雙乙酰28.23 mg/L，乙醛18.23 mg/L）。同樣，馬永哲等[40]發現綠豆皮酸奶的雙乙酰和乙醛含量在貯藏第7天時達到最大值，之后含量逐漸下降。推測其可能原因為，嗜熱鏈球菌產生的乙醇脫氫酶將乙醛還原成乙醇[34]。而雙乙酰含量下降，可能是其極不穩定，易在雙乙酰還原酶的作用下被還原為乙偶姻[42]。

此外，貯存1～14 d時牦牛酸奶感官評分無明顯變化，14 d后風味，口感、色澤和組織狀態都出現下降的趨勢。同樣，Alirezalu等[41]發現伊朗傳統酸奶在第28天貯藏期口感和組織狀態評分下降，?enel等[42]發現酸奶的香氣和風味評分在第15天時下降較大。Hanif[43]和Tarak?i[44]等發現牛奶酸奶和水牛酸奶貯藏期間的風味評分降低，這可能與蛋白質水解增加和酸度較高乳清析出有關。

圖3 貯藏期間牦牛酸奶品質的變化Fig. 3 Quality changes of yak yogurt during storage

2.6 后熟期間牦牛酸奶香氣成分變化解析

2.6.1 電子鼻傳感器響應值的變化

電子鼻具有客觀、準確、快捷、重復性好及不損傷樣品的優點，現多用于乳制品中揮發性物質的分析[45]。電子鼻傳感器信號強度可以反映出乳制品中各種揮發性成分濃度的差異。本研究結果顯示（圖4），益生菌牦牛酸奶中揮發性成分主要為氮氧化物（W5S）、甲基類（W1S）、硫化物（W1W）和醇類（W2S）。與白麗娟等[46]應用電子鼻檢測羊酸奶中主要揮發性物質為氮氧化合物、硫化氫和有機芳香硫化物的結果一致。此外，陳娟等[47]通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術發現川西高原牧區傳統發酵牦牛酸奶的主體揮發性風味物質為豐富的醇類物質，包括乙醇、3-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丁醇。張曉梅等[48]指出牦牛鮮乳中含有2-乙酰基噻唑、2-庚酮、3-辛酮、2-十一酮等甲基酮類物質。馬瑞娟等[49]指出牦牛乳中含量豐富甘油三酯更易被降解為游離脂肪酸，進而在發酵作用下轉化為甲基酮、醇、酯、內酯和醛等風味物質。這些獨特的風味化合物使得牦牛酸乳風味純香濃厚。

圖4 牦牛酸奶香氣物質雷達圖Fig. 4 Radar map of aroma substances of yak yogurt

2.6.2 牦牛酸奶香氣主成分分析（principal component analysis，PCA）

圖5 不同后熟時間牦牛酸奶香氣的PCA圖Fig. 5 PCA plot of main aroma components of yak yogurt at different post-ripening times

圖5 中每個橢圓代表牦牛酸奶后熟不同時間的數據采集點，幾個樣品分布在圖中的不同位置，通過PCA得出，PC1的方差貢獻率為95.2%，PC2的方差貢獻率為4.7%，累計貢獻率達到99.9%，大于90%，已經基本代表樣品的主要信息特征。首先，從主成分PC1和PC2兩個主軸上看，能明顯區分后熟時間不同的牦牛酸奶，說明后熟時間對牦牛酸奶的香氣影響較大。同樣，陳一萌等[7]發現隨著后熟時間延長，酸奶中揮發性風味物由33 種降至24 種。黃強等[50]發現后熟時間不同，酸奶中雙乙酰等揮發性風味物質的含量也不同。本研究還發現，后熟時間相同的牦牛酸奶與普通酸奶分屬不同區域且界線清晰，說明牦牛酸奶與普通酸奶的香氣物質有明顯差異。需利用線性判別分析（linear discrimination analysis，LDA）方法進一步確定。

2.6.3 牦牛酸奶香氣成分的LDA

由圖6可知，LD1和LD2貢獻率分別為94.8%和4.6%，兩判別式的累計貢獻率為99.4%，可以很好地識別不同后熟時間的牦牛酸奶和普通酸奶。首先，后熟時間不同的牦牛酸奶，LD1變化不大，LD2變化較大，說明牦牛酸奶風味的前體物質（乳糖、蛋白質、脂肪）隨時間延長而逐漸減少，揮發性成分增加，而風味的變化主要是由于新的揮發性成分間的相互作用引起的[51]。此外，后熟時間相同的牦牛酸奶與普通酸奶相比較，LD1相差較大，表明香氣的產生與原料乳有關聯[52]。胡凱麗等[10]也發現牦牛酸奶中的雙乙酰含量高于普通酸奶，賈凌云等[31]發現無乳糖酸奶中2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮的含量與普通酸奶中的含量存在顯著性差異。

圖6 不同后熟時間牦牛酸奶香氣的LDA圖Fig. 6 Linear discrimination analysis of the aroma of yak yogurt at different post-ripening times

3 結 論

通過響應面分析法得到牦牛酸奶最佳發酵工藝條件為HY01接種量4%、發酵時間6 h、發酵溫度40 ℃。PCA和LDA法能夠較好地識別不同后熟時間的牦牛酸奶以及區分牦牛酸奶與普通酸奶香氣成分的不同。后熟時間是影響牦牛酸奶風味的重要因素，牦牛酸奶的香氣物質主要來自牦牛奶本身、發酵劑以及發酵乳桿菌的代謝物，在香氣成分相互作用下形成不同于普通酸奶的獨特風味。貯藏期間的益生菌牦牛酸奶表現出較好的品質特性。