氣質聯用結合多元分析法比較甜橙汁與寬皮柑橘汁的香氣成分差異

周琦，易鑫，歐陽祝，李俊杰，馮雨，李貴節，談安群，黃林華，王華

(西南大學 柑桔研究所，重慶，400712)

柑橘屬(Citrus)為蕓香科植物，種植面積和產量在我國均位列第一，常見種類主要有甜橙、寬皮柑橘、柚和檸檬四大類。寬皮柑橘(Citrusreticulata)是一類果皮寬松，汁多肉粒飽滿的柑橘品種。甜橙(Citrussinensis)是一類果皮稍難剝離但果肉飽滿，汁多且味道甜酸可口的柑橘品種。隨著國內外市場變化以及柑橘產業發展，我國的柑橘品種結構嚴重失調，寬皮柑橘占了柑橘總產量的70%～80%，雖然我國已開始對柑橘種植品種結構進行調整，但2017年我國寬皮柑橘和甜橙的產量分別為1 818.77和868.58萬t，各占當年主要柑橘種類產量的52%和25%[1]，可見寬皮柑橘仍然是我國產量最大的柑橘品種[2]。

非濃縮還原 (not from concentrate, NFC)柑橘汁因極大限度地保存原汁的風味和營養，逐漸成為廣大消費者最喜愛的果蔬汁飲品之一[3]。國際上NFC柑橘汁主要以甜橙汁為主，寬皮柑橘汁占比極小，因為消費者普遍認為甜橙汁的香味優于寬皮柑橘汁。基于此，國內外研究者進行了有關實驗分析甜橙汁與寬皮柑橘汁香氣物質的差異。FENG等[4]采用GC-MS對瓦倫西亞橙和LB8-9寬皮柑橘的香氣成分進行測定，并采用香氣活度值(odor active value，OAV)計算特征香氣，發現瓦倫西亞橙中酯類和醛類物質含量要明顯高于LB8-9寬皮柑橘。成傳香等[5]通過GC-MS測定了3種寬皮柑橘汁和7種甜橙汁中的香氣成分，發現寬皮柑橘汁中的香氣物質種類和含量要低于大部分甜橙。REN等[6]采用GC-MS分別對6個柑橘品種的香氣成分進行分析，發現甜橙和蜜橘中萜類化合物存在含量差異，且萜類化合物在兩類柑橘的香氣物質中含量最高。香氣是影響柑橘加工制品品質最重要的因素之一[7]，且受不同因素的影響[8]。目前國內外的研究表明甜橙汁和寬皮柑橘汁中的香氣成分存在差異性，但研究中涉及的柑橘品種、品系均較少，且缺乏對柑橘種類間具體香氣差異研究[4, 9-10]。

我國柑橘汁生產目前是以甜橙為主，但由于寬皮柑橘產量遠高于甜橙，存在鮮銷困難[11]，未來寬皮柑橘汁產量會大大提高。本研究以16種中國主栽甜橙和寬皮柑橘為研究對象，模擬工業中柑橘汁的生產進行榨汁，利用GC-MS結合主成分分析比較兩大類柑橘汁香氣成分的具體差異，進一步在香氣物質方面為寬皮柑橘制汁提供數據支撐，從而提高我國寬皮柑橘利用率，緩解鮮果滯銷難題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

成熟甜橙果實和寬皮柑橘果實采自中國江津(東經106°16′、北緯29°18′)、中國忠縣(東經108°02′、北緯30°30′)的柑橘園和西南大學柑桔研究所國家果樹種植柑橘資源圃(東經 106°43′、北緯29°83′)，其中兩類柑橘各8種，均覆蓋多個品系，共計16種。樣品信息見表1。

表1 柑橘樣品信息Table 1 Information of citrus samples

1.1.2 實驗試劑

甲醇、C5～C25正構烷烴，色譜純，美國Honeywell公司；環己酮(濃度>99.5%)，色譜純，上海aladdin公司。

1.2 儀器與設備

SQP十萬分之一天平，賽多利斯科學儀器有限公司；H-100-DWBWIA01原汁機，惠人新生活文化傳媒有限公司；氣相色譜-質譜聯用儀(Agilent 7890 GC-5977 MSD，配備30 m×0.25 mm，0.25 μm 的DB-5MS石英毛細管色譜柱)，美國Agilent公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭(DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料處理及樣品制備

柑橘汁的制備：采摘新鮮成熟的果實，去皮榨汁，經過100目紗網精濾，裝瓶備用。

待測樣品的前處理[12]：取5 mL搖勻后的柑橘汁于 20 mL螺口萃取瓶中，準確加入內標物3 μL(采用甲醇稀釋40倍的環己酮，質量濃度14.25 μg/mL)，在萃取瓶頂空充氮20 s后封蓋，40 ℃平衡 20 min，插入SPME萃取頭，使其纖維頭暴露在萃取瓶頂空恒定深度30 min，230 ℃上機解析 5 min。

1.3.2 實驗條件

GC-MS升溫程序[13]：起始溫度35 ℃，保持0 min；再以7 ℃/min 升至98 ℃；接著以3 ℃/min升至161 ℃，最后以10 ℃/min升至241 ℃；進樣口溫度230 ℃，不分流進樣；載氣(He)流速1.2 mL/min。

EI離子源；電子能量70 eV;傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；質量掃描范圍m/z40～350。

1.3.3 樣品香氣物質的定性與定量分析

香氣物質的定性分析：各樣品的香氣成分采用安捷倫系統圖譜庫(W10 N14.L)匹配、并且以C5～C25正構烷烴保留時間為標準計算保留指數(retention index, RI)與已知RI[14]相結合的方式進行定性。

香氣物質的定量分析：參考SHUI等[15]的方法進行修改，并選取稀釋后的環己酮為內標物質，采用內標法半定量。樣品柑橘汁中香氣物質含量按公式(1)計算[13]：

(1)

式中：ρ待,待測物質的質量濃度，μg/mL；S待,待測物質的峰面積；ρ,環己酮的密度,0.95 g/mL；V1,樣品中加入環己酮的體積,mL；S1,環己酮的峰面積；V待,樣品的體積,5 mL。

1.4 數據分析處理

氣相色譜分析采用Qualitative Workflows B.08.00和Data Analysis；數據分析采用SPSS 25.0、The Unscrambler X 10.4和Microsoft Excel 365；圖片處理采用Origin 2018；所有樣品平行實驗3次，結果采用平均數表示。

2 結果與討論

2.1 主栽甜橙汁與寬皮柑橘汁總離子流圖

對中國主栽的8種甜橙和8種寬皮柑橘果汁中香氣物質的種類和含量進行了測定，采用RI結合質譜定性；其中質譜庫匹配度均高于90%，計算得到的RI與實驗得到的RI相差在0.5%以內，確保了結果的準確性。選取典型甜橙汁與寬皮柑橘為代表品種，即奧林達夏橙和新生系3號椪柑，其總離子流圖如圖1所示。甜橙汁與寬皮柑橘汁存在大量相同保留時間的物質，但其含量存在明顯的差異，且兩類果汁中含量最高的香氣物質均為D-檸檬烯。此外，兩類柑橘汁色譜圖中還存在部分香氣物質的種類不同，主要的差異集中在Area 1(保留時間：7.6～12.0 min，RI：901～1 081)和Area 2(保留時間：22.5.6～30.0 min，RI：1 387～1 586)兩個保留時間段。其中Area 1主要是單萜類化合物和少量低碳醇醛流出，Area 2主要是倍半萜類化合物和少量碳原子數較大的化合物流出。這可能是由于單萜類和倍半萜類這兩類化合物都是以異戊二烯(C5H8)n為結構單元[6]，其各自種類的分子式相同，但分子結構存在細微差異致使分子極性不同[16]，所以導致了保留時間相對集中但又各自分離。

a-奧林達甜橙汁；b-新生系3號椪柑汁圖1 典型甜橙汁與寬皮柑橘汁的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of typical sweet orange juice and mandarin juice

2.2 甜橙汁與寬皮柑橘汁中特有的香氣物質

柑橘汁的香味是多種揮發性有機物(volatile organic compounds, VOCs)混合后的綜合表現，不同種類的VOCs對香味的貢獻不同[17]。16種柑橘汁經前處理后通過GC-MS測定，檢出單萜類化合物12種，倍半萜類化合物18種，醇類化合物14種，醛類化合物13種，酮類化合物7種，酯類化合物11種以及2種其他類化合物，共計77種揮發性有機物。

甜橙汁和寬皮柑橘汁特有的香氣物質信息(去除共同含有的香氣物質)如表2所示，在8種甜橙汁樣品中檢測出來了14種特有香氣物質，包含倍半萜類3種、醇類3種、醛類2種、酮類2種及酯類6種；8種寬皮柑橘汁樣品中共檢測出7種特有的香氣物質，包含單萜類1種、倍半萜類2種、醛類1種、酮類2種及其他類1種。其中甜橙汁與寬皮柑橘汁中特有的萜類、醛類和酮類化合物種類數量相當，但甜橙汁含有寬皮柑橘汁中不存在的3種醇類和6種酯類物質，而醇類和酯類是極為重要的兩類香氣物質[18]，這也在一定程度上體現出甜橙汁的綜合香氣要優于寬皮柑橘汁。而寬皮柑橘汁中檢出1種名為百里酚的其他類揮發性有機物，其存在于大部分寬皮柑橘汁中，甜橙汁中不含有該物質。此外，甜橙汁和寬皮柑橘汁特有的香氣物質可以作為區分兩者的一個重要指標。

2.3 甜橙汁與寬皮柑橘汁香氣物質種類及含量的比較

通過將香氣物質進行分類，甜橙汁和寬皮柑橘汁的香氣物質分類匯總如表3所示。萜類化合物(單萜類和倍半萜類)在所有的柑橘品種中種類數量和含量均是最高的，可以占香氣物質總量的60%以上，與已有研究結果相吻合[19-20]。埃及橘(2-1)的單萜類化合物含量遠高于其他品種，達1 037.78 μg/mL，占比達到87%，但其倍半萜類化合物的種類和含量卻低于大部分其他柑橘品種。此外，甜橙汁和寬皮柑橘汁中單萜類化合物含量差異不顯著(P>0.05)，但甜橙汁中的倍半萜類化合物含量遠高于寬皮柑橘汁(P<0.01)。柑橘汁中的醇類物質含量僅次于萜類化合物，由表3可知甜橙汁和寬皮柑橘汁中的醇類物質雖然含量差異不顯著(P>0.05)，但甜橙汁中醇類物質的種類數量普遍高于寬皮柑橘汁。所有的甜橙和寬皮柑橘汁樣品中醛類和其他類別化合物在含量上差異不顯著，但其酮類化合物和酯類化合物含量差異顯著(P<0.01)，且甜橙汁中酯類物質的種類遠多于寬皮柑橘汁，這也與表2的結果相對應。

表2 甜橙汁和寬皮柑橘汁特有的香氣物質信息Table 2 Information of unique aromas in sweet orange juice and mandarin juice

表3 甜橙汁與寬皮柑橘汁香氣物質分類匯總表 單位：μg/mL

2.4 甜橙汁和寬皮柑橘汁特征香氣成分的比較

柑橘汁中存在部分含量高的香氣成分，但其香氣強度及其對總體香氣的貢獻不一定高，比如D-檸檬烯。通常認為，樣品中的主體香氣僅由一部分香氣物質參與構建[21]，并將 OAV>1的香氣物質定義為對樣品香氣有顯著貢獻，被稱為特征香氣成分或主體香氣成分[22]，且OAV值越高，該香氣成分對樣品香氣的整體貢獻也就越大。陳光靜等[23]認為OAV>500的香氣物質對樣品香氣會產生極顯著的影響。通過GC-MS結合內標法對樣品香氣物質定量，并結合文獻[24-27]及書籍[28-29]查詢各物質香氣閾值，計算篩選出16種柑橘汁樣品特征香氣及其OAV值見表4。

由表4可知，16種柑橘汁中共有47種特征香氣成分，其中單萜類11種、倍半萜類2種、醇類10種、醛類12種、酮類5種、酯類6種、其他成分1種。在47種特征香氣中，兩類柑橘汁的α-蒎烯、α-萜品油烯和香茅醇的OAV值都普遍大于100，芳樟醇、正己醛、壬醛的OAV值甚至達到了1 000以上，可認為這些香氣物質對兩類柑橘汁的主體香氣貢獻極大，且在兩類柑橘汁中芳樟醇的含量在醇類物質中是最高的，這也與SHUI等[15]研究結果相似。同時,甜橙汁中的β-月桂烯OAV值顯著高于寬皮柑橘汁，而寬皮柑橘汁中的γ-松油烯顯著高于甜橙汁，這說明β-月桂烯和γ-松油烯分別對甜橙汁和寬皮柑橘汁的主體香氣貢獻較大。α-紫羅酮是甜橙汁的特有香氣物質，甲基庚烯酮是寬皮柑橘汁的特有香氣物質，兩者分別對甜橙汁和寬皮柑橘汁的主體香氣起較大的作用。

此外，2-辛烯醛只在長葉香橙(1-1)和云貴橙(1-2)中檢出，且OAV值較高，其他柑橘品種不存在該物質，可認為2-辛烯醛是長葉香橙(1-1)和云貴橙(1-2)特有的、對主體香氣貢獻較大的物質。α-檸檬醛、十一醛和十二醛也只在少數柑橘品種中檢出，但這3種物質在寬皮柑橘值中的OAV值大于甜橙汁。辛酸乙酯、正己酸乙酯、丁酸乙酯和3-羥基己酸乙酯的OAV值極高，且這5種物質只在甜橙汁中檢出，是甜橙的特有香氣物質，這也從另一方面解釋了寬皮柑橘汁的總體風味不如甜橙汁的原因，與表2的結果相吻合。

2.5 主成分分析

為進一步從整體上比較甜橙汁和寬皮柑橘汁香氣物質的差異性，選取了兩類柑橘特有的香氣物質及部分共有的但含量差異明顯的物質(共計31種)，以8種甜橙汁和8種寬皮柑橘汁為分析對象，采用主成分分析對目標香氣物質的含量進行分析，結果分別如圖2和圖3所示。由三維分值圖(圖2)可知，甜橙汁和寬皮柑橘汁的樣品點在PC-1和PC-2二維平面上分別匯聚成2個獨立的集合，可明顯區分開。由相關性載荷圖(圖3)可知，β-月桂烯、順式-2,8-薄荷二烯-1-醇、反式-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環己-2-烯-1-醇、反式香芹醇、順式香芹醇、L-香芹酮和反式醋酸肉桂酯在PC-2上的相關分量達到了0.6～0.8，即這些物質在PC-1和PC-2二維平面上對 X-和Y-方向有較大貢獻。甜橙汁與寬皮柑橘汁在圖2上樣品點的分布與圖3中兩組香氣物質的分布相吻合，即上述的兩組香氣物質分別對甜橙汁和寬皮柑橘汁有較大的的貢獻，可以認為這兩組香氣物質是區分兩類柑橘汁的重要指標。同時，結合表4可知，埃及橘(2-1)和南豐蜜橘(2-5)中β-蒎烯[30]、γ-松油烯[31]和百里酚的OAV值與其他寬皮柑橘相比較有所不同，這也解釋了為什么埃及橘(2-1)和南豐蜜橘(2-5)距離其他寬皮柑橘樣品距離較遠且在三維分值圖中偏向PC-1和PC-2平面的第4象限。此外，對甜橙汁風味(X-和Y-方向)有貢獻的香氣物質主要是酯類和醇類，這也和寬皮柑橘汁中酯類和醇類香氣物質的種類和含量有一定的關系。由上述結果可知，香氣成分在兩類柑橘汁中分布具有特征性，可利用主成分分析對兩類柑橘汁進行識別區分，且對甜橙汁風味有貢獻的主要是酯類和醇類化合物。

圖2 甜橙汁和寬皮柑橘汁的三維主成分分值圖Fig.2 3D-Score plotting of principal components analysis in sweet orange juice and mandarin juice

圖3 甜橙汁和寬皮柑橘汁的主成分分值圖Fig.3 Score plotting of principal components analysis in sweet orange juice and mandarin juice 注：圖中不同種類的香氣物質采用不同的形狀和 顏色標注，中文名與之對應

3 結論

采用GC-MS對8種甜橙汁和8種寬皮柑橘汁進行測定，共檢測出77種香氣成分，41種為特征香氣(OAV>1)，甜橙汁和寬皮柑橘汁樣品中特有的香氣物質分別為14種和7種，且含量最高的香氣物質均為萜類；其中甜橙汁中酯類和醇類化合物的種類和含量遠高于寬皮柑橘汁。此外，兩類柑橘汁樣品在主成分分值圖空間分布上具有特征性，可被主成分分析進行區分和識別。

綜上，本研究通過GC-MS結合多元分析法比較了甜橙汁和寬皮柑橘汁的香氣成分種類、含量和特征香氣的差異。在成傳香等[5]基礎上增加了適宜榨汁的柑橘品系的數量，并進一步深入研究了甜橙汁和寬皮柑橘汁香氣物質的特征及其醇類和脂類物質的具體差異，相比已有研究結果更加細化和深入。基于此，后續研究可以進一步通過GC-MS-O對甜橙汁和寬皮柑橘汁中存在較大差異的酯類和醇類化合物進行測定和感官分析，然后進行主體香氣的重組及缺失實驗，探究影響甜橙汁和寬皮柑橘汁香味差異的具體物質及其含量關系。