蛋白界面膜及其評價方法研究進展

盧筠夢,趙雪,徐幸蓮

(南京農業大學 食品科學與技術學院，肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京，210095)

市面上許多常見的加工食品都是以乳狀液形式存在的多相分散體系，分散體由分散在水相中的油滴組成，如奶油、冰淇淋、醬汁、飲料等。蛋白質是這些加工食品中的重要組分，是食品加工過程中良好的綠色天然乳化劑。食品中的蛋白質大多是兩親性分子，如酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、明膠、肌原纖維蛋白和豌豆蛋白等[1]，分子表面同時含有極性和非極性基團，既能表現良好的水溶性又能在油相中分散，因此在合適條件下能夠吸附到水油界面，包裹乳化過程中形成的油滴，形成物理屏障，防止乳滴間絮凝和聚結發生[2]。通過這種方式在水油界面形成的吸附膜具有黏彈性，稱為蛋白界面膜(protein interfacial film, PIF)。PIF可以降低油滴表面的界面張力，抵抗一定的機械作用力，PIF中蛋白分子間的靜電斥力和由表面分子伸展引起的空間排阻效應是維持乳液穩定性的主要作用力[3]。因此，PIF特性與乳液的穩定性緊密相關，良好的乳液穩定性有利于維持產品的加工特性和質地，這也使得蛋白質界面結構和乳狀液性質多年來被食品膠體和界面科學領域廣泛關注。圖1展示了幾種食品PIF的模型示意圖。

掌握水油界面上蛋白界面膜的物化特性有助于了解蛋白大分子在水油界面的吸附規律，能夠用于評價、表征和預測蛋白乳液穩定性，并為優化蛋白乳化能力提供理論支持。因此，研究者們采用了多種分析方法和技術手段用以評價表征PIF。本文簡要概述了乳液PIF的形成機制以及影響其特性的內源和外源因素，系統綜述了目前用于研究PIF特性的新型手段和方法，包括微觀成像技術、熱力學技術、光譜技術和界面流變技術等，為揭示乳液PIF的形成規律，解析PIF對外界因素的響應機制提供定量和定性的分析方法，為建立PIF與乳液穩定性關系，改善蛋白乳化產品品質提供新思路。

a-不規則蜷曲狀蛋白質;b-球狀蛋白質;c-多種蛋白質絡合; d-多層蛋白質膜圖1 食品乳液中的蛋白質界面膜Fig.1 Protein interfacial films in food emulsions

1 蛋白質界面膜

1.1 PIF的形成機制

PIF的形成可分為3個階段：第1階段蛋白質擴散；第2階段蛋白質在界面吸附，通過抵抗切向剪切來防止液滴膨脹破裂，此時蛋白分子結構發生改變，體系自由能降低；第3階段蛋白分子在界面發生結構重排、交聯并固化成膜防止液滴絮凝，此時界面網絡結構形成，疏水基團充分暴露，蛋白分子間相互作用增強[4]。

蛋白分子的典型結構包括球狀及柔軟的無規則蜷曲狀(圖1)，吸附到水油界面后為獲得較低的體系自由能其構象會發生明顯變化，大多數蛋白質失去三級結構，但保留大量二級結構，導致蛋白質在界面上的三維結構和柔韌性與在溶液中大不相同。例如，許多球狀蛋白吸附到水油界面后展開，暴露出非極性和含硫氨基酸，蛋白間疏水作用增加，二硫鍵形成[5]。盡管有關蛋白質吸附到乳液界面階段具體的構象轉變，及其對蛋白乳液穩定性的影響尚未充分揭示，但仍有許多研究討論其中的變化規律。當蛋白質吸附到乳液界面時，受限的物理空間迫使蛋白質呈現出最緊密的二級結構，通常是α螺旋或β折疊[6]。蛋白質局部滲透進入油相的最簡單的構象形式是α螺旋，因此盡管部分蛋白(如牛血清蛋白)吸附到水油界面后α螺旋含量下降，但蛋白質的二級結構仍然主要由螺旋結構主導。β折疊則是蛋白質在水油界面聚集的標志，天然蛋白在吸附界面受氫鍵和疏水作用的誘導形成β折疊易于蛋白質聚集[7]。此外，水油界面蛋白質吸附的主要熱力學驅動力是油相中的非極性側鏈對蛋白質疏水殘基的相似相溶[8]，蛋白質在界面上的構象變化受油相的極性(界面張力γ)影響，吸附在極性較低的油相表面的蛋白質更容易發生構象改變，如β乳球蛋白在正十四烷/水界面(γ=53 mN/m)比在橄欖油/水界面(γ=29.5 mN/m)吸附更緊密[9]，這是因為低極性油相在蛋白吸附時更易誘導產生非天然的α螺旋，引起吸附蛋白結構重排。巰基向二硫鍵轉化有利于吸附蛋白聚集成膜，部分天然蛋白，如乳清分離蛋白和肌原纖維蛋白，巰基埋藏在分子內部，這些蛋白經吸附、解折疊后活性巰基暴露，蛋白分子間通過二硫鍵交聯成膜[10]。因此，含有豐富巰基的半胱氨酸殘基有利于穩定PIF的結構，對水油界面吸附的蛋白質的構象重排有顯著影響，對于沒有巰基或巰基含量較少的混合蛋白質，則主要通過疏水相互作用和氫鍵來穩定PIF中蛋白質間的相互作用[11]。

1.2 影響PIF特性的因素

一般來說，PIF復雜結構的形成是分子間引力和斥力微妙平衡的結果，包括靜電作用力、離子鍵、范德化力、氫鍵、疏水效應和構象熵引起的空間排阻等[12]。產生強烈排斥相互作用的PIF能更好地抑制液滴聚集，維持乳液穩定，最主要的穩定機制就是靜電斥力作用和空間排阻作用。靜電斥力是一種長程相互排斥作用，當PIF包覆的液滴攜帶同種電荷時，液滴間存在靜電斥力，這種相互作用的強度通常隨著界面層的厚度和親水性的增加而增加[13]。空間排阻則是一種短程相互排斥作用，產生于2個鄰近液滴表面PIF的重疊，其相互作用的強度也隨著PIF厚度和親水性的增加而增加[14]。相比靜電斥力，空間排阻由于不易受環境干擾而更穩定。因此，任何打破上述吸引力與斥力平衡或對2種穩定作用力產生影響的因素均會影響PIF特性。

影響PIF特性的內源因素很多，包括蛋白質的組成和種類、表面疏水性、蛋白濃度和電荷特性等。在PIF形成過程中，膜蛋白的構象極大地受到其氨基酸殘基分布的限制。通常，蛋白中含有大比例親水性氨基酸殘基時呈現細長的棒狀；當其中含有大比例疏水殘基時，蛋白分子傾向于呈現球狀。一旦球狀蛋白吸附到水油界面就開始解折疊暴露更多的氨基酸殘基，隨后形成橫向的蛋白間相互作用，因此球狀蛋白形成的PIF厚度較小且表面活性較高[15]。對于不同蛋白質，形成的PIF和穩定液滴的方式也存在細微差異，例如球狀蛋白β-乳球蛋白和α-乳白蛋白形成薄而致密的PIF，主要通過靜電斥力來穩定乳液液滴；而酪蛋白則形成厚而分散的PIF，通過空間排阻和靜電斥力來防止乳液絮凝[3]。表面疏水性在PIF形成的第1階段影響蛋白的吸附速率。天然狀態的蛋白疏水區域大部分埋藏在分子內部，但在PIF形成的第2、3階段，在疏水區域脫水的熵增驅動下，蛋白的高級結構發生改變，結構重排使得疏水殘基盡可能地暴露在油相中。蛋白濃度對PIF的影響主要體現在第1階段，由濃度梯度驅動的擴散控制吸附動力學可以用Ward-Tordai模型描述，如公式(1)所示。

(1)

式中：kD，擴散速率；π，界面表面壓力(界面張力與溶液差)；c0，體相中的蛋白濃度；k，波爾茲曼常數；T，絕對溫度；D，蛋白擴散系數。

許多研究表明,蛋白濃度越高，擴散速率越快。當濃度較高時，蛋白由強靜電斥力主導分子間相互作用，膜蛋白形成更致密的構象[16]。PIF的電荷特性決定液滴間靜電作用力的強弱，靜電斥力強度隨著表面電荷數量的減少而下降，相反，具有足夠高電荷的PIF可以產生強烈的靜電斥力，從而有效防止乳液中懸浮液滴的接近[17]。為方便研究電荷特性對PIF的影響，通常以“剪切平面”處的電勢(zeta potential，ζ)進行表征，代表強烈吸附反離子的液滴在電場中能移動的最遠距離[18]。

外界環境，如pH、離子強度、溫度和冷凍條件等，也會對PIF的結構和性能產生顯著影響。氨基和羧基的存在使兩親性蛋白質在較低pH下帶正電，在較高pH下帶負電，在遠離等電點pH條件下靜電斥力和離子水化利于蛋白結構展開及巰基的活化，易于形成PIF。當pH接近蛋白等電點時，蛋白分子的展開受到抑制，蛋白溶解度降低，不利于PIF形成，并且由于蛋白之間的疏水作用達到最大，靜電斥力逐漸消失，此時蛋白質包覆的油滴傾向于相互靠近發生絮凝，乳液容易失穩[19]。許多蛋白類食品乳化產品中含有鹽離子，PIF周圍環境中離子強度影響靜電斥力的大小和范圍。加入鹽離子可導致乳清分離蛋白PIF所帶負電荷減少，靜電斥力減小[19]。當乳液中含有較高水平鹽離子或者含有多層反離子時，還會產生靜電屏障效應，使水油界面上帶電膜蛋白的靜電斥力受到屏蔽[20]。食品產品的加工、儲藏過程中存在溫度波動，熱變性溫度可誘導蛋白分子發生構象變化，使最初位于蛋白內部的非極性基團和巰基暴露，PIF的表面疏水性增加[13]。冷凍是最常見的貯藏方式，但冷鏈技術不健全易引起貯存期間凍融循環的發生，引起乳液物理化學特性變化。反復冷凍-解凍阻礙PIF的形成，首先蛋白與油脂交聯的能力降低，減少了吸附到水油界面的有效蛋白含量。其次，已吸附的蛋白變性程度增大，使蛋白表面疏水性增強，促進蛋白相互作用形成大分子蛋白，蛋白溶解度降低，乳化液微粒直徑增大，最終無法形成穩定的PIF且乳化能力下降[21]。

綜上，在內源因素和外界環境的共同影響下，若被PIF包覆的油滴的凈吸引力(主要是范德化力和疏水效應)大于凈排斥力(主要是靜電排斥和空間排阻)，則PIF穩定能力下降、液滴聚集，不同油滴表面PIF上的蛋白分子就有可能發生巰基交換反應，形成共價二硫鍵，將液滴結合在一起，乳液發生失穩現象[22]。

2 PIF評價方法研究進展

2.1 微觀成像技術

人的肉眼僅可以分辨大于100 μm的物體，然而食品中許多常用乳化劑微粒的尺寸遠低于該值。各種顯微成像技術可觀察這些精細結構，直觀地提供復雜系統的相關信息。最廣泛的用于PIF觀察的有光學顯微鏡(如激光掃描共聚焦顯微鏡)、電子顯微鏡(如掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡)和原子力顯微鏡等。激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)通過激光掃描合成界面結構的三維立體圖像，用來確定乳液中液滴的空間位置,并獲得關于絮凝體的詳細信息[23]。電子顯微鏡的分辨率高于光學顯微鏡，透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)與光學顯微鏡原理相似，但是以電子束作光源，用電磁場作透鏡，由于電子束穿透力有限，對樣品的厚度有一定要求。掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)用細聚焦電子束在樣品表面掃描時激發出來的各種物理信號來調制成像，只能獲得關于界面表面結構的二維圖像。原子力顯微鏡(atomic force microscopy, AFM)則具有更高的分辨率，可觀察到更微小的界面結構，呈現聚集體的形態和大小信息，但是原子力顯微鏡成像技術要求使用脫水樣品，因此有時需要結合動態光散射測量[24]。

李偉偉[25]用CLSM觀察到大豆蛋白形成的乳液粒徑較大，出現橋聯絮凝現象，從而推測出大豆蛋白吸附速度過慢，蛋白濃度不足以有效覆蓋液滴界面，天然大豆蛋白乳化性能不足。采用TEM觀察大豆肽在乳液中形成的網狀結構，發現由于其肽鏈分布稀疏，不易在界面上形成高強度的多層吸附膜結構[25]。黃穎等[26]用TEM觀察經加熱處理的β-乳球蛋白，發現蛋白質的粒徑逐漸減小，分布密集程度增加，最后呈現纖維化且直徑變粗，表明β-乳球蛋白發生水解，部分以β折疊結構為主的片段在靜電排斥和疏水作用共同平衡下有序聚集，蛋白分子間相互作用增強，形成的PIF界面強度較高。通過CLSM和SEM觀察比較高壓處理對堿提取鱈魚蛋白的影響，發現當壓力由20 MPa上升至100 MPa時，被鱈魚蛋白包裹的油滴直徑顯著降低且分布更加均勻。SEM在30.0 k放大倍數下還可清晰地觀察到吸附在油滴表面的蛋白微粒[27]。利用AFM對界面吸附平衡后的蛋白膜進行表征，發現β-乳球蛋白界面膜網絡結構存在一定的交疊或聚集，結合其他表面性質參數推斷其表面游離巰基含量較高，易形成二硫鍵導致PIF形成過程中界面分子間發生交聯[28]。

2.2 熱力學方法

蛋白吸附初始階段，靜電力和疏水相互作用下乳液體系釋放大量熱能，驅動蛋白質繼續吸附到界面上，達到平衡狀態后，電荷中和引起的構象變化導致體系從放熱轉變為吸熱。因此與蛋白質結構穩定性相關的熱力學研究有助于揭示PIF的形成規律。其中，蛋白自然構象(折疊態)和變性構象(展開態)之間的能量躍遷，是表征蛋白空間結構變化的直接指標，也是研究PIF形成過程中蛋白三級結構和四級結構變化的關鍵。差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)是一種廣泛采用的熱分析技術，DSC圖譜的峰值溫度Tm代表蛋白變性溫度，反映蛋白結構的穩定性;焓變H代表引起構象變化所需的能量，是吸熱效應(如氫鍵的破壞)和放熱效應(如疏水相互作用的破壞)的疊加，DSC是直接測量H的唯一方法[29]。采用DSC技術測定蛋白熱變性情況，結果表明吸附至水油界面后蛋白變性峰減小或消失[30]。近年來,許多研究期望通過調控PIF形成來提升乳液穩定性，DSC為達到上述目的提供了檢測手段。根據蔡汝瑩[31]的實驗結果，加入血漿蛋白、雞蛋分離蛋白、酪蛋白酸鈉可以改變肌原纖維蛋白的Tm，使蛋白內部疏水基團暴露，形成分子間疏水相互作用，促進二硫鍵形成，增強蛋白分子結構穩定性，從而提高PIF強度。脈沖超聲也可以增強PIF穩定性，DSC結果表明,肌球蛋白的Tm隨處理時間增加而降低，由于分子間疏水相互作用增加,蛋白分子內作用力被破壞，蛋白分子結構穩定性降低，與此同時,H數值在脈沖超聲處理的前6 min下降,而后在9～15 min出現回升，證明蛋白質發生解折疊，分子內疏水鍵受破壞，分子間疏水鍵形成，促進PIF形成[32]。

2.3 光譜技術

2.3.1 色氨酸熒光光譜

熒光光譜廣泛應用于表征蛋白結構和蛋白相互作用，光激發固有的熒光基團至高能狀態，然后測量樣品吸收光的發射情況。蛋白中主要的熒光基團是色氨酸的吲哚基團，其發射熒光強度對溶劑極性高度敏感，因此色氨酸光譜的變化可用來識別蛋白在水油界面上吸附時的構象變化。當色氨酸殘基從疏水環境移動到親水環境時，最大發射波長發生紅移；相反色氨酸殘基由親水環境移向疏水環境時發生藍移[33]。在295 nm左右的激發波長下，埋藏在蛋白疏水核或結合在疏水溶劑中的色氨酸殘基以最大波長約335 nm發射。而蛋白變性后暴露在親水溶劑中的色氨酸發射波長紅移至355 nm左右。在普通熒光光譜中，光以90°的入射角激發樣品，但在乳液中由于大量的光被吸收或散射，發射的熒光不足以到達探測器，導致信號較差。為了避免這一問題，水油乳液中的研究通常采用表面色氨酸熒光光譜。入射角調整為30°～60°(不設置45°)，光穿透前10 μm，一部分反射到90°的探測器上，從而獲得良好的信號。GUO等[34]研究發現,牛血清蛋白在魚油/水界面上的構象變化受疏水效應驅動，乳液中的熒光發射光譜出現藍移現象，這是因為色氨酸殘基與電子吸收配體間形成氫鍵，蛋白中疏水區域也被重新定向到油相的疏水區域。該研究表明PIF的形成與油相的極性相關，最大發射波長的移動程度可隨油相極性的增加而縮小。而在含10%大豆油的乳液中，大豆分離蛋白吸附到水油界面后,熒光發射最大位置發生紅移而非藍移，排除了色氨酸位于疏水區域并插入油相的可能性。此外，由于混合蛋白質在形成PIF時發生蛋白間相互作用，因此光譜上大豆分離蛋白紅移的程度小于組成它的2種蛋白(大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)各自紅移的距離[33]。

2.3.2 傅里葉變換紅外光譜

水油界面蛋白質的二級結構也可以通過傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)進行測定。光譜中的峰是化學鍵振動吸收能量的結果，酰胺I區(1 580～1 720 cm-1)和酰胺II區(1 510～1 580 cm-1)對蛋白質結構的表征尤為重要，而氫鍵和過渡偶極子間的耦合是調控蛋白質酰胺帶構象敏感性的兩大關鍵因素[35]。典型二級結構的峰值分布如下：β折疊(1 610～1 631 cm-1)，無規則卷曲(1 638～1 648 cm-1)，α螺旋(1 649～1 660 cm-1)，β轉角(1 660～1 680 cm-1)以及β反向折疊(1 680～1 692 cm-1)。通過高斯函數可計算得到相應的峰值面積[36]，用于表征不同二級結構的比例。FTIR適用于研究各種環境下的蛋白質，其優點在于既可觀察連續相的蛋白質，也可觀察特定位點的蛋白質，并且該技術對蛋白質體系沒有擾動。此外，乳液產生的光散射不會干擾其信號，因此FTIR被廣泛應用于測量吸附在水油界面上蛋白質的構象。

FANG等[37]較早使用FTIR研究了β-乳球蛋白吸附到大豆油水油界面的構象變化。結果表明，吸附導致分子內β折疊減少，α螺旋不變，無規則卷曲增加以及分子間β折疊減少。同時，研究指出環境pH對乳液有顯著影響， pH 6.0 時乳液中蛋白較pH 7.0時更易發生變性。LEFEVRE等[38]得出相似結論，pH=6 時β-乳球蛋白無規則卷曲和分子間β折疊更多，而pH=7時α螺旋含量更高。然而在SAKUNO等[39]的研究中，乳球蛋白在二酰基甘油/水和三酰基甘油/水界面的分子間β折疊增加，甚至只能檢測到細微的結構變化。這些研究的差異在于FTIR在提取蛋白質信號時需要從乳液光譜信號中分別減去水相和油相的光譜信號。由于純油相的信號與乳液中油相信號存在差異，而油相濃度又較高，導致最后所得的蛋白質信號存在誤差。SCHESTKOWA等[40]改進了FTIR的計算方法，結合熒光光譜和懸滴分析法確定了β-乳球蛋白在中鏈三酰基甘油/水乳液的臨界界面質量分數為0.2%～0.31%。

2.3.3 拉曼光譜

拉曼光譜是FTIR的互補技術，當分子的偶極矩隨著分子的振動而變化時，適用FTIR進行檢測；而當分子的極化率隨著分子的振動而變化時，適用拉曼光譜進行檢測[41]。拉曼光譜最有價值的信息是酰胺I帶(1 650～1 680 cm-1)和III帶(1 240～1 300 cm-1)，前者常被用于鑒定PIF形成前后蛋白二級結構的構象變化，后者涉及的信息包括C-N拉伸帶和肽鍵平面彎曲振動中的N-H，這些波段的頻率主要取決于PIF形成過程中蛋白狀態、環境及分子間相互作用[42]。水油界面大豆分離蛋白的拉曼光譜顯示，隨著體系由酸性到堿性變化，酰胺I帶的信號峰值逐漸增強，表明pH變化引起膜蛋白二級結構的構象變化[43]。同時，拉曼光譜可以提供膜蛋白側鏈氨基酸的微環境，包括鏈間二硫帶、色氨酸帶、酪氨酸帶和脂肪族疏水殘基等相關三級結構的信息。形成PIF的蛋白質通常失去三級結構而保留多種二級結構，二硫鍵作為維持蛋白質三級結構的重要二級鍵，其含量是表征蛋白質構象變化的關鍵信息。500～550 cm-1的伸縮振動來源于2個半胱氨酸形成的二硫鍵，在510、525和545 cm-1左右的峰值分別表征3種不同構象中的二硫鍵：鄰式-鄰式-鄰式(g-g-g)、鄰式-鄰式-反式(g-g-t)和反式-鄰式-反式(t-g-t)。此外，脂肪族氨基酸殘基在2 800～3 000 cm-1的C-H伸縮振動和1 440～1 465 cm-1的C-H彎曲振動也可用于監測PIF形成過程中的疏水相互作用及構象的轉變[13]。比如，光譜在2 930和2 880 cm-1的信號強度比(I2 930/I2 880)可以反映蛋白吸附到油水界面后分子內的C-H鏈偏轉/反式構象變化，2 853和2 880 cm-1的相對信號強度比(I2 853/I2 880)則可以反映分子間C-H鏈相互作用[44]。研究表明，添加多糖會影響PIF的穩定性，恰當的蛋白/多糖比例能促進更多的蛋白質疏水側鏈插入油相中，有利于提高PIF包裹油滴的穩定性[45]。

2.4 界面流變學

乳化過程不受熱力學主導，且由于乳化區域的面積較大，乳液穩定性更多表現出動力學不穩定性，發生乳化、絮凝和聚結等失穩現象。因此，從食品工業角度來看，首要目標是提高乳液的動力學穩定性。評價PIF的界面流變性對表征乳液穩定性具有關鍵意義，它研究的是乳化過程中液滴界面形變及外加應力隨時間變化的關系，通常通過向液滴施加膨脹應力或者剪切應力進行測量。在低頻率外力擾動時，黏性流動液體的彈性模量可忽略不計，但固體中流動行為受到阻礙，彈性模量充分表征其力學行為。添加乳化劑后，水油界面同時表現出黏性和彈性特性。通過測量界面張力和彈性模量可以預測蛋白質在水油界面的吸附過程，在蛋白質擴散階段界面張力和黏彈性模量保持不變；當界面單層膜形成并發生蛋白結構重排時，界面張力急劇下降，彈性模量急劇增加；若界面“凝膠化”并形成多層吸附的界面膜，界面張力緩慢下降(尤其是球狀PIF)，黏彈性模量緩慢增加。

膨脹流變適用于測定乳液短期穩定性，施加外力時流體的界面面積改變，而界面形狀保持不變[46]。利用Langmuir槽法、液滴擴張技術、界面張力弛豫等方法可研究不溶性單分子層和界面蛋白膜，針對蛋白在界面的吸附建立非牛頓流體行為模型[47]。蛋白界面膜的形成、結構展開和重排都可通過膨脹流變學監測。此外，剪切流變提供了更豐富的中長期穩定性信息，在剪切變形中流體的界面形狀改變，而界面面積保持不變[47]。利用流變儀搭配磁棒、雙錐、Du Noüy環等可對蛋白的界面剪切流變性質進行檢測，并提供水油界面上分子間和分子內蛋白質相互作用的信息[48]。ZHU等[49]對比了乳清分離蛋白和牛血清蛋白的界面流變特性，發現前者的PIF表現出較大的膨脹黏彈性模量，這是因為乳清蛋白具有致密的球狀結構，通過交聯在水油界面形成更穩定PIF，而牛血清蛋白由于吸附量低無法形成致密的PIF。ULAGANATHAN等[50]通過滴形分析技術研究了十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate, SDS)與β-乳球蛋白的競爭性吸附作用，SDS隨著濃度的增加逐漸取代β-乳球蛋白占據界面主導地位。較低的SDS濃度對界面張力影響不大，但對剪切彈性和黏度有影響，因為剪切流變檢測分子間互作比檢測界面張力表現出更高的靈敏度。動態流變測定還可用于研究不同蛋白的界面性質和競爭性吸附。對于吸附可逆的蛋白質，隨著界面上吸附蛋白先后經歷解吸附、隨油滴膨脹重新吸附的過程，界面動態彈性模量隨吸附時間的增加呈現先增加后略有下降的趨勢[51]。當用肌原纖維蛋白置換雞蛋分離蛋白和血漿蛋白時，界面張力皆顯著下降且低于肌原纖維蛋白界面張力，出現這一結果的原因是在水油界面上肌原纖維蛋白和其他2種蛋白間發生競爭吸附，雞蛋分離蛋白和血漿蛋白在油滴表面的PIF相對堅固，肌原纖維蛋白僅能取代少量外層吸附蛋白，在整個置換過程中雞蛋分離蛋白和血漿蛋白仍占主導地位[31]。PIF形成第一階段PIF的流變特性研究目前正處于快速發展的階段，界面流變技術可以提供通過其他檢測手段難以獲得的關于PIF的有效數據和信息。

3 結語與展望

PIF性質對水油乳液的穩定性有顯著影響，盡管研究者們對界面蛋白構象變化及界面流變的研究已取得了一定成果，但其與乳液之間的直接關系尚未明確，仍需更多詳細、深入的研究。研究者已通過觀察外觀形貌(微觀成像技術)、尋找結構變化的間接證據(熱力學方法)、直接測量構象變化(光譜技術)、綜合研究動態吸附過程和界面穩定性(界面流變學)，從不同角度測定并分析PIF。微觀成像技術最直觀地給出了有關界面膜微觀構造和尺寸的信息，其中AFM的應用為研究蛋白質聚集體和配體提供了極大便利。熱力學方法為吸附過程中蛋白質的構象變化提供了有效的間接證據，DSC已廣泛應用于蛋白質高級結構的研究。現代光譜技術的出現使蛋白質二、三級結構信息的獲取成為可能，FTIR用于觀察水油界面上的蛋白質吸附行為，提供蛋白的二級和三級結構信息，拉曼光譜補充了界面膜蛋白質的二級結構和側鏈的相關信息，熒光測量則能有效反映蛋白質吸附到水油界面過程中的氨基酸環境變化。盡管現代光譜技術迅速發展，且因其方便快捷的特點而越來越受研究者歡迎，但是尚存在一定局限。例如，熒光光譜無法檢測二級結構且制樣耗時。水相中蛋白質的FTIR光譜容易受到極性水溶劑的干擾。拉曼光譜固有的拉曼散射可能影響光譜的分辨率，長時激光輻射產生的熱量也可能改變蛋白質構象從而影響測量精度。界面流變學的發展使蛋白質界面性質研究向前邁進一大步，該技術通過結合介觀和微觀尺度上的參數信息，解決了流體-流體界面蛋白質構象變化及其表面流變行為的相關問題。但對于復雜PIF的動力學問題，僅憑界面流變技術無法徹底解決，需要進一步建立能正確描述復雜界面動力學的模型。因此，綜合使用這些技術將形成優勢互補，為PIF的定量結構分析提供更準確有效的信息。

雖然環境因素對PIF結構影響的研究較多，但相關的乳液穩定性調控方法及響應機制仍有待建立。現有研究中，通過調控PIF的形成過程提升乳液穩定性，通過改變蛋白構象，增強蛋白柔韌性，提高蛋白乳化活性，引起水油界面中吸附蛋白高級結構變化，從而提高蛋白乳化特性。常見的調控方法有超高壓處理技術、超聲處理技術、酸堿處理技術、糖基化修飾技術等。未來PIF的相關研究工作可從以下展開：第一，提高目標乳液體系的多樣性，包括系統性探究不同水油比例和不同蛋白來源的乳液PIF。當前大多數有關PIF的研究都是基于水包油的乳液體系，體系中油相比例較低而水相比例較高，探究高油相比例的PIF形成情況有利于更好理解PIF對油包水乳液穩定性的作用機制和規律。此外，現有的PIF研究對象集中于水溶性蛋白，如β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清蛋白、卵清蛋白、寡聚蛋白等，而以肉源性蛋白為代表的鹽溶性蛋白形成的PIF研究則較少，相關的PIF形成機制需要進一步明確。第二，建立適用于復雜流體的PIF分析模型。上文已證明界面流變特性對PIF表征的重要性，及其用于建立蛋白乳化液宏觀與微觀聯系的有效性。一些研究者嘗試建立數學分析模型，通過關聯PIF的黏彈性性質、微結構參數、組成和界面張力來預測蛋白對乳液的穩定作用，廣泛應用的有Young-Laplace方程、Ward-Tordai方程、一階唯象方程、梅森模型等，未來仍需建立更精確的模型用于描述復雜PIF的吸附行為和特性。第三，發展基于計算機科學和信息技術的動態界面監測技術。目前對PIF界面流變性能的監測實驗中界面相對靜止，蛋白質可以有序吸附，而實際情況下蛋白質吸附到水油界面形成PIF是一個動態的乳化過程，相鄰液滴間有拉普拉斯作用力且可能存在共享相同PIF等情況。因此PIF的未來發展依賴于電子信息技術的發展、智能分析軟件的開發以及全面的動態界面監測設備的設計。