山楂粗糖蛋白對高脂小鼠降脂及抗氧化作用的初步研究

高雪婧，羅思奕，湯凱潔，羅秋水

(江西農業大學 食品學院,江西 南昌,330045)

山楂為薔薇科植物山楂(CrataeguspinnatifutaBge.)的干燥成熟果實，具有健脾開胃、消食化滯等功效[1]。現代藥理學研究證明，山楂具有降血脂作用，能明顯降低總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯 (triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平，升高高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C) 水平[2-3]，可以用來預防和治療高血脂，且無副作用。山楂屬于藥食同源的優質原料，從中已分離鑒別出總黃酮、三萜酸和植物甾醇[4]等多種降血脂活性成分，但目前國內外鮮見有研究其糖蛋白降血脂活性成分。糖蛋白(glycoprotein)是一類糖類與多肽或蛋白質以共價鍵連接而形成的結合蛋白，作為一種糖和蛋白質的復合物，具有多方面的生物活性，如抗氧化[5]、免疫調節作用[6-8]、體外抗腫瘤活性[9]、降血脂[10]等。

隨著人們生活水平的提高，膳食結構的改變對人體健康產生了重要影響，高脂血癥發生率逐年攀升。通過膳食干預有效調節血脂代謝，提高機體抗氧化酶活性，減少脂質過氧化產物，已成為大眾關切的問題[11-13]。本文通過制備山楂粗糖蛋白來探究其對高脂小鼠的降脂及抗氧化能力，以期為開發新型糖蛋白產品的降脂、抗氧化功能提供一定的理論依據，同時也為山楂的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂市售；清潔級KM雌性小鼠(質量：18～22 g)50只，實驗鼠維持飼料，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2016-0002；食用豬油，四川溢州油脂有限公司；膽固醇、脫氧膽酸鈉、丙硫氧嘧啶、吐溫-80、丙二醇，國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、乙醚等試劑均為分析純；TC、TG、HDL-C、過氧化氫酶(catalase，CAT)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)，總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒，北京普利萊基因技術公司。

1.2 儀器與設備

TGL-20000CR高速臺式冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；RE-3000旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；FD-1 真空冷凍離心機，北京博醫康技術公司；Multiscan MK3酶標儀，美國Thermo electron公司；旋渦混合器，美國Thermo Scientific公司；BS-100A 自動部分收集器；DW-86 W420 J醫用低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 山楂粗糖蛋白樣品的制備

新鮮山楂洗凈去核，50 ℃烘干后粉碎備用。稱取一定質量的山楂粉末，設置超聲功率150 W、料液比1∶20(g∶mL)、超聲時間30 min，重復3次提取樣品，雙層紗布過濾，5 000 r/min離心15min除去沉淀，在所得的上清液中加入體積分數75%的乙醇，5 000 r/min離心15 min,重復3次沉淀樣品，所得沉淀溶于蒸餾水中，Sevage法去除游離蛋白，離心所得沉淀經真空冷凍干燥得到樣品粉末。取樣品粉末溶解配制質量濃度為10 mg/mL的溶液，上DEAE-52 纖維素樹脂柱，依次用0.10、0.30、0.50、0.70、0.90 mol/L的NaHCO3進行梯度洗脫，收集蛋白質和多糖重疊峰的洗脫液進行透析，真空冷凍干燥得到微紅色山楂粗糖蛋白粉末，然后進行Sephadex G-75純化，再次收集洗脫液真空冷凍干燥得到白色山楂粗糖蛋白粉末，通過考馬斯亮藍法測定波長在595 nm處和苯酚-硫酸法檢測波長在490 nm處吸光度的方法[14]，測得山楂粗糖蛋白純度為69.15%。

1.3.2 高脂乳劑的配制

參考白冰瑤等[12]、胡文兵等[15]方法制備高脂乳劑。油相：20 g豬油、10 g膽固醇、1 g丙硫氧嘧啶、20 mL吐溫-80；水相：20 mL丙二醇、2 g脫氧膽酸鈉、30 mL蒸餾水。油相加熱至融化，將混合充分的水相倒入油相中不斷攪拌，充分溶解后冷卻至室溫，加蒸餾水定容到100 mL，4 ℃保存，使用時水浴回溫至37 ℃。

1.3.3 動物分組及建模

50只雌性KM小鼠適應性飼喂3 d后，隨機分為5組：空白對照組、高脂模型組、山楂粗糖蛋白低、中、高劑量組。飼養期間小鼠自由飲水、攝食，每日投放等量飼料，飼養溫度為室溫條件。每天定時灌胃，每周定時稱重,每日處理情況見表1。

表1 小鼠分組及每日處理Table 1 Grouping and daily treatment of mice

1.3.4 血清、肝臟采集與處理

灌胃8周后，對小鼠禁食12 h，記錄體重，乙醚麻醉后解剖小鼠，心臟采血，4 ℃條件下3000 r/min離心10 min，分離上清液。肝臟稱取質量，用生理鹽水清洗拭干置于離心管中，-80 ℃下冷藏[16-17]。

1.3.5 小鼠血脂及抗氧化能力測定

根據試劑盒操作測定血清中TC、TG、HDL-C含量及肝組織勻漿中CAT、T-SOD、T-AOC活性和MDA含量。

1.3.6 數據處理

實驗數據用平均值±標準差表示，SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan新復極差法進行多重比較，Origin Pro 8.5.1軟件制圖，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 山楂粗糖蛋白對小鼠血脂的影響

高脂乳劑灌胃導致小鼠血脂異常，而山楂粗糖蛋白可改善高脂小鼠血清的TC、TG、HDL-C水平[18-19]。

表2 山楂粗糖蛋白對小鼠血清TC、TG和 HDL-C含量的影響 單位：mmol/L

由表2可知，與空白對照組相比，高脂模型組TC、TG水平極顯著升高(P<0.01)，高脂模型組HDL-C水平極顯著降低(P<0.01)，表示高脂小鼠已成功建模。同時，與高脂模型組相比，山楂粗糖蛋白劑量組的TC、TG均顯著降低,HDL-C水平顯著升高(P<0.01)。由此可知，山楂粗糖蛋白能有效改善高脂小鼠血清TC、TG和HDL-C的水平。

2.2 山楂粗糖蛋白對小鼠肝臟抗氧化能力的影響

高脂膳食會增加體內自由基生成量，導致小鼠發生氧化應激，激發脂質過氧化產物的形成，使得肝臟抗氧化酶活性降低[21-22]。

2.2.1 山楂粗糖蛋白對小鼠肝臟CAT的影響

由圖1可知，高脂模型組CAT活性遠低于空白對照組(P<0.01)，表明高脂乳劑抑制了小鼠體內的CAT活性；與高脂模型組相比，山楂粗糖蛋白低劑量組對CAT活性有一定提高，而中、高劑量組對CAT活性極顯著提高 (P<0.01)，由此表明，山楂粗糖蛋白能有效增強高脂小鼠體內CAT活性。

圖1 山楂粗糖蛋白對小鼠肝臟CAT活性的影響Fig.1 Effect of the crude glycoprotein from hawthorn on CAT activities in mice liver

2.2.2 山楂粗糖蛋白對小鼠肝臟MDA的影響

由圖2可知，高脂模型組MDA活性水平極顯著高于空白對照組(P<0.01)，說明在高脂乳劑的誘導下小鼠處于氧化應激狀態，致使體內MDA升高[23]；與模型組相比，山楂粗糖蛋白低、中、高劑量組的MDA含量顯著降低(P<0.01)，說明山楂粗糖蛋白具有良好的抗氧化性，能起到減弱組織的氧化損傷的程度，清除氧化應激代謝產物的功能。

圖2 山楂粗糖蛋白對小鼠肝臟MDA水平的影響Fig.2 Effect of the crude glycoprotein from hawthorn on MDA contents in mice liver

2.2.3 山楂粗糖蛋白對小鼠肝臟T-SOD的影響

由圖3可知，與空白組相比，高脂模型組T-SOD活性明顯降低(P<0.05)；與高脂模型組相比，山楂糖蛋白低劑量組T-SOD活性明顯提高(P<0.05)，而中、高劑量組極顯著提高(P<0.01)，表明山楂粗糖蛋白能有效提高小鼠體內的T-SOD活性，具有良好的抗氧化能力。

圖3 山楂粗糖蛋白對小鼠肝臟T-SOD活性的影響Fig.3 Effect of the crude glycoprotein from hawthorn on T-SOD activities in mice liver

2.2.4 山楂粗糖蛋白對小鼠肝臟T-AOC的影響

由圖4可知，與空白對照組相比，高脂模型組T-AOC 極顯著降低(P<0.01)，表示高脂建模組有效降低了機體的總抗氧化能力；與模型組相比，山楂粗糖蛋白中、高劑量組T-AOC極顯著提高 (P<0.01)，而低劑量組T-AOC有一定提高，說明山楂粗糖蛋白能有效提升高脂飲食誘導小鼠肝臟中總抗氧化能力。

圖4 山楂粗糖蛋白對小鼠肝臟T-AOC活性的影響Fig.4 Effect of the crude glycoprotein from hawthorn on T-AOC activities in mice liver

3 結論與討論

無論人體還是動物長期飲食高脂食物會引起代謝紊亂，導致血清中TC、TG等升高和HDL-C降低，從而引起肝內脂肪堆積，形成高血脂、脂肪肝等。相關研究表明，高脂血癥與高血糖、高血壓等有重要關系，且與冠心病的發病關系很密切。同時，高脂膳食會使體內代謝增高產生大量自由基，引起代謝產物MDA含量增大，MDA對細胞具有嚴重的毒副作用；然而MDA又極易修飾低密度脂蛋白，促使泡沫細胞形成，由此促進動脈粥樣硬化等心血管疾病的形成。CAT、T-SOD是體內2種重要的抗氧化酶，正常情況可及時清除體內氧化代謝產物，保護細胞免受傷害。但當人體內氧化應激水平過高時，其活力大幅度下降，引起氧化與抗氧化之間的平衡失調，從而引發一系列代謝性疾病[24-25]。植物來源的抗氧化劑安全且廉價；山楂作為深受大眾青睞的原料，具有良好的降脂保健功能和酸甜可口的獨特風味，已被加工為山楂片、復合飲料等多種形式的食品[26-29]。目前有關山楂的研究多集中于新產品的配方研制及工藝優化，少有研究其有效成分對于體內的降脂和抗氧化作用，因此，對于其糖蛋白作用機理的研究仍需進一步闡明。

本研究通過連續喂養4周高脂乳劑的方法建立高脂模型小鼠，以空白組作對照，通過連續喂養4周山楂粗糖蛋白低、中、高劑量組來探討其對高脂模型小鼠肝臟降脂及抗氧化作用。結果表明：山楂粗糖蛋白中、高劑量組TC、TG水平顯著升高(P<0.01)和HDL-C水平顯著下降(P<0.01)，山楂粗糖蛋白低劑量組TC水平明顯升高(P<0.05)、TG水平顯著升高(P<0.01)和HDL-C水平顯著下降(P<0.01)，說明山楂粗糖蛋白能有效改善高脂小鼠血清TC、TG和HDL-C的水平;山楂粗糖蛋白低劑量組對CAT、T-SOD活性和T-AOC有一定提高，而中、高劑量組顯著提高CAT、T-SOD活性和T-AOC (P<0.01)；山楂粗糖蛋白低、中、高劑量組的MDA含量顯著提高(P<0.01)；由此說明山楂粗糖蛋白對高脂飲食誘導小鼠具有較好的抗氧化性能。綜上所述，山楂粗糖蛋白能有效調節高脂小鼠血脂代謝，提高機體抗氧化能力，并在研究范圍內具有顯著量效關系，為山楂的綜合利用開發提供參考價值。