濃香型白酒糟醅中酵母Geotrichumsp.的固態(tài)發(fā)酵特性

游玲，譚壹，隆清揚，陳宏，周榮清，趙東*

1(固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室(宜賓學(xué)院)，四川 宜賓，644000) 2(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都，610065)

白酒固態(tài)自然發(fā)酵糟醅中的酵母區(qū)系構(gòu)成明顯不同于液態(tài)自然發(fā)酵，酵母通過影響糟醅中微生物共代謝網(wǎng)絡(luò)參與白酒風(fēng)味塑造的途徑也更加多樣，闡明白酒糟醅中優(yōu)勢酵母的發(fā)酵功能是解析白酒發(fā)酵機理的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)Pichiaanomala、Pichiakudriavzevii、Zygosaccharomycesbailii等與多種香型白酒中風(fēng)味物質(zhì)生成有關(guān)[1-4]。白地霉(Geotrichumcandidum)作為一種重要的芳香微生物，近年來也在白酒發(fā)酵糟醅中檢測到[5-7]。盡管關(guān)于Geotrichum是否為Dipodascus屬仍存在爭議[8-9]，但這一重要酵母類群在多種香型白酒糟醅中的廣泛存在已無爭議，但目前對該酵母在白酒糟醅中的發(fā)酵特性仍缺乏了解。

本課題組在多糧濃香型白酒發(fā)酵40 d糟醅中檢測到豐度80%左右的Geotrichumsilvicola，而已有研究表明，多糧濃香型白酒發(fā)酵糟醅中后期糟醅的乙醇含量有一次明顯的升高[10]，且糟醅中并未檢測到可產(chǎn)乙醇的細(xì)菌[11]，推測其可能是在發(fā)酵中后期糟醅中起著持續(xù)發(fā)酵產(chǎn)乙醇的作用。本研究針對分離自多糧濃香型白酒糟醅的2株Geotrichumsp.酵母，研究其在糟醅中的生長特征及主要代謝產(chǎn)物，以初步揭示其在多糧濃香型白酒發(fā)酵糟醅中的發(fā)酵功能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

糟醅：選擇正常生產(chǎn)的五糧液生產(chǎn)車間某窖池，采用趙東等[11]取樣及DNA提取方法，分別取發(fā)酵0、4、12、18、24、30、40、60和68 d的樣品各200 g，用于酵母平板計數(shù)、菌株分離及DNA提取。

釀酒酵母：“安琪”白酒專用活性干酵母。

1.2 實驗方法

1.2.1 兩株酵母在原位發(fā)酵糟醅中的生長特征

酵母計數(shù)：樣品經(jīng)無菌水連續(xù)稀釋后，分別涂布于添加0.1 g/L氨芐青霉素的WL-瓊脂培養(yǎng)基和L-YPD培養(yǎng)基(乳酸調(diào)節(jié)pH至5.0)。28 ℃培養(yǎng)48 h，選擇具有30～100個菌落的L-YPD平板進行酵母計數(shù)。

豐度檢測：15 g樣品與2 g直徑為1 mm的無菌玻璃珠和15 mL緩沖液在50 mL離心管中劇烈混合15 min，200 r/min 離心5 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移到另一個50 mL離心管中，用無菌水洗滌并沉淀，重復(fù)2次。將3次的上清液轉(zhuǎn)移到試管中混合，以14 000 r/min 離心10 min。提取糟醅總DNA，采用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)擴增D1/D2特征序列，將通過瓊脂糖凝膠電泳檢查合格的PCR產(chǎn)物送至美吉測序公司(上海)測序。將獲得的所有OTU與酵母模式菌株的相應(yīng)序列進行比對，計算與2株酵母分類單位相同的OTU序列數(shù)量占總序列數(shù)量的比例(即該分類單位的豐度)，再乘以糟醅酵母總數(shù)得到該分類單位的酵母數(shù)量，以此繪制該分類單位酵母在發(fā)酵糟醅中的生長曲線。

1.2.2 菌株分離鑒定

分離：根據(jù)高通量測序結(jié)果，選擇發(fā)酵12 d及發(fā)酵40 d的糟醅，采用WL及L-YPD培養(yǎng)基分離酵母菌株，挑取2種培養(yǎng)基上的純培養(yǎng)菌株，經(jīng)3次純化后，將純培養(yǎng)菌株接種至L-YPD瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)48 h，4 ℃保藏備用。

形態(tài)觀察：將活化的酵母菌株接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基平板上，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，觀察酵母菌在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，同時制備酵母菌裝片，在400倍下觀察細(xì)胞形態(tài)。

生理生化鑒定：以葡萄糖、山梨醇、木糖、甘露醇、肌醇、蔗糖、鼠糖、麥芽糖、阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、棉子糖為YNB培養(yǎng)基中的唯一碳源培養(yǎng)酵母，觀察其生長情況，評價其對糖的同化能力；將酵母菌接種到尿素培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h，根據(jù)培養(yǎng)基是否變紅色評價酵母利用尿素的能力。

序列鑒定：挑取新鮮菌落至1.5 mL EP管，按照E.Z.N.A Yeast DNA試劑盒的步驟提取純酵母菌株的DNA，隨即按照1.2.1小節(jié)中方法擴增其26S rDNA序列，擴增產(chǎn)物送至派森諾公司(上海)測序，獲得的序列提交至GenBank進行BLASTN(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比對。

1.2.3 溫度、乙醇、pH對酵母生長的影響

菌株活化：用乳酸調(diào)節(jié)YPD培養(yǎng)基pH為5.0，挑取平板菌落接種，28 ℃下100 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

溫度對酵母生長的影響：5 mL菌懸液轉(zhuǎn)接到pH 為5.0(乳酸調(diào)節(jié))的YPD培養(yǎng)基中，分別在20、24、28、32、36、40 ℃下以100 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，測OD560值。

乙醇對酵母生長的影響：5 mL菌懸液轉(zhuǎn)接到乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的YPD培養(yǎng)基(乳酸調(diào)節(jié)pH至5.0)中，28 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，測OD560。

pH對酵母生長的影響：5 mL菌懸液轉(zhuǎn)接到pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的YPD培養(yǎng)基(乳酸調(diào)節(jié)pH)中，28 ℃、100 r/min培養(yǎng)36 h，測OD560。

1.2.4 模擬發(fā)酵實驗

固態(tài)發(fā)酵：以多次煮沸清洗并滅菌的糠殼基質(zhì)作為固態(tài)載體，吸附按生產(chǎn)工藝配比的五糧粉，添加不同強度的關(guān)鍵生長脅迫因子，調(diào)節(jié)水分含量至55%，滅菌后接種由0.5%的根霉菌劑干粉制備的液體菌劑，分裝到已滅菌的2 kg容量的呼吸袋，分別接種在乳酸YPD培養(yǎng)基中活化24 h的2株酵母菌株，25 ℃發(fā)酵20 d，期間于0、4、8、12、16、20 d分別取樣檢測糟醅理化指標(biāo)及酵母菌數(shù)量，發(fā)酵起始及結(jié)束時取樣檢測糟醅中風(fēng)味物質(zhì)含量。

液態(tài)發(fā)酵：在固態(tài)發(fā)酵糟醅中同時添加2倍體積的無菌水，裝入2.5 L廣口瓶發(fā)酵，其余步驟同上。

1.2.5 糟醅成分分析

取100 g糟醅或發(fā)酵液，加入200 mL蒸餾水，常壓蒸餾，收集餾出液至100 mL，采用氣相色譜法(配FID檢測器)測定糟醅蒸餾液中的乙醇及主要風(fēng)味物質(zhì)含量[12]。

按照國標(biāo)[13]第一法——直接滴定法測定糟醅中還原糖含量；采用pH計測定糟醅pH；糟醅酸度、淀粉及水分含量測定方法根據(jù)《白酒理化分析檢測》[14]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Geotrichum sp.酵母在原位發(fā)酵糟醅中的生長特征

由圖1可知，Geotrichumsp.酵母主要活躍在濃香型白酒4～60 d的發(fā)酵糟醅中，在發(fā)酵12、40 d時各有一個數(shù)量高峰期，在濃香型白酒發(fā)酵旺盛期(12 d前后)數(shù)量達到105CFU/g，可能參與乙醇的生成，但此時該酵母在群體中的豐度很低，推測Geotrichumsp.不是主發(fā)酵期間產(chǎn)乙醇的主要種屬。在發(fā)酵24～40 d內(nèi)該酵母數(shù)量維持在104CFU/g以上，特別是在發(fā)酵40 d的濃香型白酒糟醅中，此時其他種屬酵母大幅減少，Geotrichumsp.酵母在酵母群體中的豐度達到70%以上，但此時糟醅中乙醇含量上升已不明顯[15]，表明Geotrichumsp.酵母并未在這一階段增加乙醇的生成。發(fā)酵中后期該酵母在酵母群體中的豐度迅速增加，推測其對缺氧環(huán)境更加耐受，但此時其絕對數(shù)量已低至103CFU/g以上，與這一時期大量增殖的細(xì)菌群體相比完全不占優(yōu)勢，很難在這樣復(fù)雜的微生物共代謝體系中準(zhǔn)確辨析Geotrichum酵母的作用，因此需分離純培養(yǎng)菌株研究其發(fā)酵特性。

圖1 Geotrichum sp.酵母在原位發(fā)酵糟醅中的豐度 及數(shù)量變化趨勢Fig.1 Trend of relative abundance and quantity of Geotrichum sp.in fermented grains

2.2 Geotrichum sp.酵母的分離鑒定

根據(jù)Geotrichumsp.酵母在糟醅中的生長特征，采用2種培養(yǎng)基分別在窖池發(fā)酵12 d及發(fā)酵40 d的糟醅中各分離到1株Geotrichumsp.酵母，其26S rDNA部分序列與模式菌株對應(yīng)序列相似性大于99%，且與高通量測序方法檢測到的僅有的2個OTU完全吻合，分別編號為LB0-2、WA5-4。

通過NCBI檢索，發(fā)現(xiàn)這2株酵母的26S rDNA部分序列分別與G.silvicola、Geeotrichumcandidum(同G.candidum)、G.bryndzae、G.geotrichum標(biāo)準(zhǔn)菌株對應(yīng)序列的相似性均高于99%，僅通過26S rDNA序列比對無法將其準(zhǔn)確鑒定到種，系統(tǒng)發(fā)育分析也證實了這一點(圖2)。

圖2 兩株Geotrichum sp.酵母基于26S rDNA序列的 系統(tǒng)發(fā)育分析圖Fig.2 Phylogenetic analysis of 26S rDNA sequence of two Geotrichum sp.strains 注:鄰接點法，自展數(shù)1 000

從菌落形態(tài)特征來看，2株酵母的菌落及細(xì)胞形態(tài)略有差異(圖3)，WA5-4酵母在L-YPD瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)2 d，形成米白色、輻射狀、邊緣絨毛狀的濕潤微凸菌落，容易挑取，略帶烘焙香氣；LB0-2在同樣條件下培養(yǎng)，形成白色、絨毛狀的濕潤平鋪菌落，容易挑取，有典型酵母香氣。但2株酵母在乳酸YPD及WL固體及液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～10 d均未見假菌絲形成，糖利用實驗表明，2株酵母均可同化葡萄糖、山梨醇、木糖、甘露醇，不能同化肌醇、蔗糖、鼠糖、麥芽糖、阿拉伯糖、水楊素、乳糖、半乳糖、棉子糖，能夠利用尿素，類似于地霉屬[16-17]，因此暫將其鑒定為Geotrichumsp.。

圖3 Geotrichum sp.酵母的菌落及細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Colonies and cells of two Geotrichum sp.strains 注:L-YPD培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3 d

2.3 兩株Geotrichum sp.酵母菌株的生長特征

在L-YPD液體培養(yǎng)基中，Geotrichumsp.酵母菌株的生長特征見圖4。2株酵母接種至pH 5.0的液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)4 h后即進入對數(shù)生長期，其中LB0-2菌株在培養(yǎng)10 h時數(shù)量達到最高，WA5-4菌株增殖較為緩慢，在培養(yǎng)18 h才達到最大值，表明WA5-4菌株的增殖能力似乎不如LB0-2菌株。

在乳酸YPD培養(yǎng)基中測試糟醅中主要生長脅迫因子對2株酵母生長的影響，發(fā)現(xiàn)2株酵母對溫度、低pH、乙醇的耐受性也存在一定差異。濃香型白酒發(fā)酵糟醅的溫度從窖池邊角處的20 ℃左右到窖池中心點逐漸升高，極端情況下可能升高至50 ℃，在本研究條件下，2株酵母的最適生長溫度均為28 ℃，但LB0-2菌株對高溫的耐受性更好，在40 ℃時仍有明顯生長，可能更耐受糟醅發(fā)酵過程中的高溫；濃香型白酒糟醅中的最高乙醇體積分?jǐn)?shù)為6 mL/100 g左右，液態(tài)培養(yǎng)基中，2株酵母均可耐受4%乙醇，且LB0-2菌株在乙醇體積分?jǐn)?shù)達到8%時仍生長良好，WA5-4菌株乙醇體積分?jǐn)?shù)達到6%時也有明顯生長，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)達到8%(白酒糟醅中的最高乙醇含量為6 mL/100 g左右)時仍生長良好，表明糟醅中的乙醇不是這2株酵母的主要生長限制因子；濃香型白酒糟醅中的pH為3.0～3.5左右，液體培養(yǎng)基中，2株酵母在pH 4.0時均生長良好，隨著pH下降到3.0時，WA5-4菌株的生長明顯受到抑制，但LB0-2菌株受影響較小，在pH 3.0時仍有明顯生長。

圖4 兩株Geotrichum sp.酵母菌株的生長特征Fig.4 Growth characteristics of two Geotrichum sp. strains

2.4 兩株酵母在固態(tài)發(fā)酵糟醅中的產(chǎn)乙醇特征

圖5顯示2株酵母及釀酒酵母接種至模擬糟醅發(fā)酵過程中糟醅中淀粉的轉(zhuǎn)化情況，接種WA5-4、LB0-2及釀酒酵母的糟醅中淀粉分別消耗了22%、16%和13%，發(fā)酵結(jié)束時糟醅中的還原糖含量分別為1.4%、4.3%和3.7%，因此WA5-4、LB0-2及釀酒酵母實際分別消耗糟醅中的淀粉20.6%、11.7%和9.3%，可見同等條件下，2株Geotrichumsp.酵母可發(fā)酵糟醅中更多淀粉，特別是WA5-4，其利用淀粉的量甚至超過釀酒酵母的2倍，但從乙醇生成情況來看，2株Geotrichumsp.酵母都沒有產(chǎn)生比釀酒酵母更多的乙醇，推測其消耗相同的碳源生成了更多的發(fā)酵副產(chǎn)物。

圖5 2株Geotrichum sp.酵母對糟醅中淀粉及還原糖轉(zhuǎn)化的影響Fig.5 Effects of two Geotrichum sp.strains on the transformation of starch and reducing sugar in fermented grains

如圖6所示，WA5-4、LB0-2及釀酒酵母在濃香型白酒糟醅中發(fā)酵24 d時的乙醇產(chǎn)量分別為7.91、6.71和7.03 mL/100 g，其中WA5-4菌株顯著高于其他2株酵母，并且，考慮在發(fā)酵16 d時糟醅中的乙醇含量因酯化等原因有不同程度的下降(圖8)，其實際乙醇產(chǎn)量可能更高。從產(chǎn)乙醇速率來看，釀酒酵母啟動發(fā)酵更快，在發(fā)酵4 d時其乙醇產(chǎn)量已達5.40 mL/100 g，占其最終產(chǎn)量的77%，隨后增長較緩慢，而2株Geotrichumsp.酵母體現(xiàn)出明顯的長時間持續(xù)發(fā)酵特征，特別是WA5-4菌株，在發(fā)酵20 d后仍能持續(xù)產(chǎn)生乙醇，這在發(fā)酵周期長達70 d的濃香型白酒發(fā)酵過程中可能更具實際意義。

同時，分別比較2株酵母在固液態(tài)糟醅中的乙醇產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)LB0-2、WA5-4菌株在固態(tài)發(fā)酵糟醅中的乙醇產(chǎn)量(6.63、5.31 mL/100 g)均顯著高于其分別在液態(tài)發(fā)酵糟醅的產(chǎn)量(3.09、1.48 mL/100 g)，方差也顯著小于液態(tài)發(fā)酵糟醅，表明這2株酵母在固態(tài)發(fā)酵糟醅中產(chǎn)乙醇更多更穩(wěn)定，且WA5-4在固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵糟醅中產(chǎn)乙醇量均顯著高于LB0-2。

圖6 兩株Geotrichum sp.酵母在固態(tài)發(fā)酵糟醅 中的產(chǎn)乙醇特征Fig.6 Ethanol producing of Geotrichum sp.strains in solid state fermentation grains

2.5 Geotrichum sp.酵母對糟醅水分及酸度的影響

糟醅水分變化在一定程度上反應(yīng)了微生物代謝旺盛程度，由圖7可知，接種WA5-4菌株的糟醅發(fā)酵過程中水分含量增加更多，特別是在發(fā)酵第4～8 d內(nèi)增加尤為迅速，8～24 d期間也在持續(xù)緩慢增加，且一直高于LB0-2及釀酒酵母，觀察也可發(fā)現(xiàn)呼吸袋內(nèi)壁凝結(jié)的水霧更密集，表明該酵母在糟醅中的代謝更加旺盛。

圖7 兩株Geotrichum sp.酵母對糟醅水分的影響Fig.7 Effect of two Geotrichum sp.strains on water content of fermented grains

圖8可知，2株Geotrichumsp.酵母菌株的產(chǎn)酸能力有很大差異。WA5-4菌株產(chǎn)酸較釀酒酵母晚，但其在發(fā)酵4～8 d期間及整個發(fā)酵階段的產(chǎn)酸量均顯著高于其他2株酵母，LB0-2在0～16 d期間的產(chǎn)酸量與釀酒酵母沒有顯著差異，但其最終產(chǎn)酸量顯著低于釀酒酵母，可能是由于發(fā)酵后期因酯化等有所損失。從糟醅pH變化來看，接種釀酒酵母的糟醅pH顯著低于接種2株Geotrichumsp.酵母的糟醅，這可能是由于釀酒酵母所產(chǎn)有機酸更容易電離出H+，而2株Geotrichumsp.酵母產(chǎn)有機酸的種類較多，反而有利于維持糟醅pH平衡，這在一定程度上更有利于維持固態(tài)發(fā)酵糟醅的酸環(huán)境。

圖8 兩株Geotrichum sp.酵母對糟醅pH及酸度的影響Fig.8 Effect of two Geotrichum sp.strains on pH and acidity of fermented grains

2.6 Geotrichum sp.酵母固液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)情況

如表1所示，2株Geotrichumsp.酵母在固液態(tài)糟醅中主要產(chǎn)13種風(fēng)味物質(zhì)，其中，WA5-4菌株在固態(tài)糟醅中的風(fēng)味物質(zhì)總產(chǎn)量達2.7 g/kg，其中產(chǎn)量超過100 mg/kg的物質(zhì)包括乙酸乙酯、異丁醇、乙酸異戊酯、β-苯乙醇。LB0-2在固態(tài)糟醅中的風(fēng)味物質(zhì)總產(chǎn)量甚至高達4.4 g/kg，其產(chǎn)量超過100 mg/kg的物質(zhì)包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯、β-苯乙醇。因此推測Geotrichumsp.酵母在濃香型白酒發(fā)酵過程中的主要貢獻是產(chǎn)乙酸乙酯、乙酸異戊酯、β-苯乙醇，且乙酸乙酯是濃香型白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，主要呈花果香，這2株菌在糟醅中的乙酸乙酯產(chǎn)量分別為1.5、3.0 g/kg，同樣且呈花果香且風(fēng)味閾值較低的乙酸異戊酯產(chǎn)量也高達216、573 mg/kg，呈玫瑰花香的β-苯乙醇產(chǎn)量分別為658、477 mg/kg，因此，Geotrichumsp.酵母可能有助于強化濃香型白酒的花果香氣。

值得注意的是，WA5-4菌株、LB0-2菌株在固態(tài)發(fā)酵糟醅中的風(fēng)味物質(zhì)總產(chǎn)量均顯著高于液態(tài)發(fā)酵糟醅，分別為液態(tài)發(fā)酵糟醅的91倍及340倍，其中WA5-4菌株在固態(tài)發(fā)酵糟醅中的乙醛、乙酸乙酯、異丁醇、異戊醇、乙酸異戊酯、糠醇、β-苯乙醇產(chǎn)量顯著高于液態(tài)發(fā)酵糟醅，LB0-2菌株在固態(tài)發(fā)酵糟醅中的乙醛、乙酸乙酯、異丁醇、正丁醇、乙酸、異戊醇、乙酸異戊酯、正己醇、糠醇、β-苯乙醇產(chǎn)量顯著高于液態(tài)發(fā)酵糟醅，體現(xiàn)出Geotrichumsp.酵母對固態(tài)發(fā)酵糟醅的特殊適應(yīng)性。

表1 兩株酵母在固態(tài)及液態(tài)發(fā)酵糟醅中的主要揮發(fā)性產(chǎn)物Table 1 Volatile products of two yeast strains in fermented grains of solid and liquid fermentation

3 討論

Geotrichum屬的典型特征是形成假菌絲，本研究涉及的2株酵母僅與本屬內(nèi)4個種的26S rDNA序列相似性大于99%，與其他真菌或酵母的序列相似性均低于98%，但在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)均未形成菌絲，懷疑是該屬內(nèi)的1個新種，有待進一步研究。

從發(fā)酵功能來看，Geotrichum屬的多個種與水果香風(fēng)味特征聯(lián)系緊密，如高產(chǎn)酯類物質(zhì)及苯乙醇的Galactomycesgeotrichum(G.candidum)[18-19]，高產(chǎn)乙酸乙酯的G.penicillatum[20]，部分菌株還可通過降解葡萄酒中的高級醇生成酯類物質(zhì)改善葡萄酒風(fēng)味的[21]，但總體上關(guān)于Geotrichum屬發(fā)酵產(chǎn)乙醇的報道較少，本研究發(fā)現(xiàn)Geotrichumsp.酵母對濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵糟醅適應(yīng)良好，在固態(tài)發(fā)酵糟醅中可通過高產(chǎn)乙酸乙酯、乙酸異戊酯、β-苯乙醇強化濃香型白酒的花果香氣，可長時間持續(xù)發(fā)酵，具有開發(fā)為新型白酒商業(yè)酵母的潛力。