畢赤酵母產伏馬毒素B1羧酸酯酶發酵條件和培養基的優化

趙一凡，常曉嬌，杜穩，孫長坡，劉虎軍

(國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京，100037)

伏馬毒素(fumonisins)主要是由串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)產生的一種次級代謝產物[1-2]，在自然界中是一種分布比較普遍的真菌毒素。目前共發現28種伏馬毒素[3]，其中伏馬毒素B1(fumonisin B1，FB1)的占比最高、毒性最強、分布最廣，主要污染玉米及玉米制品[4-5]。伏馬毒素隨著食物鏈傳遞會嚴重危害人畜的健康，人類食用被伏馬毒素污染的食品可能會誘發食道癌、結腸癌等多種疾病[6-7]；豬、馬、牛等動物取食被伏馬毒素污染的飼料，會對其器官產生致命毒性，從而引起多種疾病[8]。糧油食品被伏馬毒素等真菌毒素污染后將會造成巨大的經濟損失，產生嚴重的環境污染問題。

伏馬毒素非常穩定，250 ℃熱處理也不能脫除玉米中的伏馬毒素[9]。目前有物理法和化學法等脫毒方法[2]，但這些方法還存在破壞食品營養價值、安全性低、穩定性差等問題。除此以外，生物法利用微生物或酶的作用可將伏馬毒素轉化為低毒或無毒產物，脫毒效果穩定且無污染，是一種非常有前景的方法[10]。其中微生物法在很多食品加工等領域并不能廣泛適用，相比之下酶法具有操作簡單、專一性強、催化效率高等優點而廣受青睞。FB1生物降解的本質是在酶的催化下完成的，HEINL等[11]在Sphingopyxissp.MTA144的同一個基因簇上找到了降解FB1的2個關鍵基因，FB1經2步酶促反應降解：在羧酸酯酶的作用下，FB1被降解為HFB1，毒性顯著降低[12]；在轉氨酶的作用下HFB1發生轉氨反應，最終轉化成2-酮基-HFB1。

優化發酵條件和培養基成分，創造適合菌體生長和代謝的最佳條件以充分發揮菌種的潛力，是提高FB1羧酸酯酶產量的首要步驟。由于微生物發酵系統十分復雜且高度非線性，因此需要建立一個準確適合的發酵模型。人工神經網絡技術是對人類大腦的一種物理結構上的模擬，其中誤差反向傳播神經網絡即BP神經網絡在擬合復雜的非線性關系方面具有顯著優勢，已廣泛應用于培養基優化[13]、發酵過程控制[14]等發酵工業領域。

目前已鑒定的FB1降解酶數量十分有限，關于FB1羧酸酯酶等降解酶的發酵優化也少有報道。本研究以實驗室前期構建的畢赤酵母工程菌(ASAG156)為FB1羧酸酯酶的生產菌株，通過單因素試驗對發酵條件進行優化，通過Plackett-Burman試驗、正交試驗和BP神經網絡模型對發酵培養基進行優化，以充分發揮菌株的生產性能，進一步提高FB1羧酸酯酶的產量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

FB1羧酸酯酶產生菌：畢赤酵母工程菌ASAG156，由本實驗室構建并保藏。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈(色譜級)，美國Thermo Fisher公司；FB1標準品，PriboLab公司；酵母粉，英國Oxoid公司；蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司；其他常用生化試劑均為進口或國產分析純。

1.1.3 培養基及溶液

酵母膏胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)培養基(g/L)：葡萄糖 20，酵母粉 10，蛋白胨 20；固體YPD培養基另外加入20 g/L的瓊脂粉。

BMGY培養基(g/L)：酵母粉 10，蛋白胨 20，無氨基酵母氮源(yeast nitrogen base, YNB)13.4，生物素 4×10-4，甘油 10，磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)0.1 mol/L。

BMMY培養基(g/L)：酵母粉 10，蛋白胨 20，YNB 13.4，生物素 4×10-4，甲醇 10，磷酸鉀緩沖液(pH6.0)0.1 mol/L。

FM22生長培養基(g/L)：KH2PO443，(NH4)2SO45，CaSO4·2H2O 1.27，K2SO414.3，MgSO4·7H2O 11.7，PTM4 2(mL/L)，甘油 40，KOH溶液調節PH至6。

FM22誘導培養基(g/L)：KH2PO443，(NH4)2SO45，CaSO4·2H2O 1.27，K2SO414.3，MgSO4·7H2O 11.7，PTM4 2(mL/L)，甲醇 10，KOH溶液調節PH至6。

PTM4(Pichiatrace minerals 4)微量元素溶液(g/L)：CuSO4·5H2O 2，KI 0.089，MnSO4·H2O 3，Na2MoO4·2H2O 0.2，H3BO30.02，CaSO4·2H2O 0.5，CoCl20.5，ZnCl27，FeSO4·7H2O 22，生物素 0.2，濃硫酸 1 mL/L。

1.1.4 儀器與設備

ECOTRON型恒溫搖床，瑞士Infors公司；Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；EVOLUTION 300紫外可見分光光度計，美國Thermo Fisher公司；Waters e2695高效液相色譜儀、2475熒光檢測器、Waters XBridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國Waters公司；PP60型pH計，德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養條件

種子活化：取適量保存在冷凍甘油管中的菌液劃線接種于YPD固體平板上，30 ℃培養48～72 h。

種子培養：挑取單菌落接種于YPD液體培養基中，30 ℃、200 r/min條件下，培養24 h。

1.2.2 發酵條件優化

將經YPD培養后的種子液以體積分數為5%的接種量接入BMGY培養基中，30 ℃、200 r/min條件下培養16～24 h，OD600達到5～6，將全部細胞轉接到BMMY培養基中進行誘導；搖瓶發酵初始條件：初始pH 6.0，在30 ℃下進行誘導，每24 h補加體積分數為1%的甲醇，誘導72 h取樣并測定發酵上清中FB1羧酸酯酶酶活力。在下列條件下依次進行單因子搖瓶發酵優化實驗。

(1)誘導時間：誘導溫度30 ℃，初始pH 6.0，每24 h補加體積分數為1%的甲醇。分別在24、48、72、96和120 h取樣并測定酶活力，確定最佳誘導時間。

(2)甲醇體積分數：誘導溫度30 ℃，初始pH 6.0，每24 h分別補加體積分數為0.5%、1%、2%和3%的甲醇，96 h取樣并測定酶活力，確定最佳甲醇添加量。

(3)培養基初始pH：誘導溫度30 ℃，配制初始pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的培養基，每24 h補加體積分數為1%的甲醇，96 h取樣并測定酶活力，確定最佳培養基初始pH。

(4)誘導溫度：誘導溫度分別為25、28、30和35 ℃，初始pH 6.0，每24 h補加體積分數為1%的甲醇，96 h取樣并測定酶活力，確定最佳誘導溫度。

1.2.3 發酵培養基優化

1.2.3.1 Plackett-Burman 試驗設計

在FM22誘導培養基的基礎上，添加10 g/L酵母粉，20 g/L蛋白胨組成新的發酵培養基，使用Minitab軟件進行Plackett-Burman 試驗設計和結果分析，研究發酵培養基中的8種成分。每個因素取高(+1)、低(-1)2個水平，以酶活力為響應值。各組分及其水平設置見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計確定的因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design

1.2.3.2 正交試驗

根據Plackett-Burman 試驗設計結果，以蛋白胨、KH2PO4、PTM4為變量，各因素設計3水平，正交試驗因素與水平如表2所示。

表2 正交試驗因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3.3 BP人工神經網絡模型

使用Matlab R2018a軟件，以正交試驗結果作為訓練和測試數據樣本，根據培養基影響因子和優化目標確定神經網絡的輸入輸出。

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 FB1的HPLC檢測

FB1前處理及儀器的檢測條件參考GB 5009.240―2016《食品安全國家標準 食品中伏馬毒素的測定》。

1.2.4.2 粗酶液制備

取一定量的發酵液置于離心機中，12 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.4.3 酶活力測定

測定方法參照文獻[15]。酶活力定義：在37 ℃和pH 7.4條件下，每分鐘降解1 μg FB1所需的酶量定義為1個酶活單位(U)。

2 結果與分析

2.1 單因素搖瓶發酵條件優化

由圖1-a可知，隨著甲醇誘導時間的延長，發酵上清液中酶活力逐漸增大，在96 h酶活力達到最大，誘導時間繼續延長而酶活力沒有明顯增大，因此選擇誘導96 h進行后續實驗。培養基中甲醇是重組菌的碳源和誘導劑，體積分數合適的甲醇可以滿足酵母生長和產酶。由圖1-b可知，隨著甲醇體積分數的增大，酶活力逐漸增大，當甲醇體積分數為1%時酶活達到最大，繼續增大甲醇體積分數，酶活力迅速降低，過多的甲醇會對菌體產生毒害作用[16]，使產酶量降低，因此選擇體積分數為1%的甲醇進行后續實驗。培養基初始pH會影響細胞膜所帶電荷和培養基內的物質解離，從而影響菌體的代謝能力和產酶，同時pH會影響酶的穩定性。由圖1-c可知，中性和堿性條件下酶活力較低，而當培養基初始pH為6.0時酶活力達到最大，因此選擇pH 6.0為發酵培養基初始pH進行后續研究。每種菌的發酵產酶都有一個適宜的溫度范圍來使其產酶達到最優水平，由圖1-d可知，重組菌產酶隨著誘導溫度的降低而升高，這表明低溫誘導有利于胞外產酶，但誘導溫度過低加大了能耗提高了發酵成本，因此選擇28 ℃為誘導溫度。

a-誘導時間；b-甲醇體積分數；c-pH；d-誘導溫度圖1 搖瓶發酵條件優化Fig.1 Shaking flask optimization of fermentation conditions

經發酵條件優化，FB1羧酸酯酶酶活力有了顯著提高，即搖瓶最適發酵條件為培養基初始pH 6.0，每24 h補加體積分數為1%的甲醇，在28 ℃下誘導96 h，發酵上清液中酶活力為300 U/mL，較優化前提高了63%。

2.2 發酵培養基優化

FB1羧酸酯酶已在畢赤酵母工程菌中實現了表達，但BMMY這種復合培養基中包含價格高且需單獨過濾除菌的YNB和生物素等成分，操作不便；同時與發酵罐常用的BSM基礎鹽培養基成分差別較大。FM22培養基是在BSM培養基基礎上改進后的另一種合成培養基，具有較強的適應性[17]、縮短發酵延遲期和發酵時間、提高比生長速率等優點[18]。這些基礎鹽培養基在滅菌后均會出現大量乳白色沉淀，限制細胞的生長同時增大了蛋白下游分離提取純化等環節的難度。所以對FM22培養基成分的優化將有助于目的蛋白的表達和分離純化。前期實驗發現，菌體在FM22生長培養基中能利用其豐富的鹽離子正常生長，但FM22誘導培養基中需添加有機氮源，FB1羧酸酯酶才能正常表達。因此參考BMMY培養基配方，將酵母粉和蛋白胨添加到FM22誘導培養基中，在搖瓶最優發酵條件下，對新的發酵培養基進行優化。

2.2.1 Plackett-Burman 試驗結果分析

在最優發酵條件下進行培養基優化實驗，按照表1對發酵培養基中8種成分進行考察，以篩選出對酶活有顯著影響的因素進一步優化。按照Plackett-Burman試驗設計表設計，8個因素12次實驗，每個試驗號酶活取平均值。Plackett-Burman試驗設計結果及顯著性分析見表3和表4。

表3 Plackett-Burman試驗設計結果Table 3 Results of Plackett-Burman experimental design

因素H的P值<0.05，對酶活力影響顯著；因素A的P=0.05，處于邊緣狀態，在處理時和H一并確認為本試驗的顯著影響因素，即蛋白胨和KH2PO4為酶活力的顯著影響因素。對酶活力影響排第3的因素是PTM4，由于PTM4中包含Cu2+、Mn2+、Na+、Ca2+、Zn2+、Fe2+和Co2+等金屬離子及生物素等，可以提供畢赤酵母用于生長和外源蛋白表達所需的微量元素[19]，因此將PTM4和蛋白胨、KH2PO4這3個因素作為接下來優化試驗的研究對象。其他對酶活力影響不顯著的因素：(NH4)2SO4、CaSO4·2H2O、K2SO4、MgSO4·7H2O和酵母粉，采取Plackett-Burman試驗低水平濃度，減少鹽離子質量濃度和沉淀的產生，同時節約成本，即K2SO47.15 g/L、MgSO4·7H2O 5.85 g/L和酵母粉 5 g/L。

表4 Plackett-Burman試驗各因素的影響Table 4 Effects of factors in the Plackett-Burman experiment

2.2.2 正交試驗結果分析

利用Minitab軟件進行正交設計和結果分析。采用L9(34)正交表設計并安排試驗，因素水平見表2，以酶活力為考察指標，對影響酶活力的3個因素蛋白胨、KH2PO4、PTM4進行正交試驗，每個試驗號重復3次，酶活力取平均值。試驗設計及結果見表5，方差分析見表6。

表5 正交試驗結果Table 5 Results of orthogonal experiment

表6 方差分析Table 6 Analysis of variance

由表5正交試驗結果可知，各因素對酶活力的影響程度依次為蛋白胨>KH2PO4>PTM4。由表6方差分析結果可知，蛋白胨和KH2PO4這2個因素對酶活力有顯著影響(P<0.05)，為主要因素；PTM4這個因素對酶活力的影響不顯著(P>0.05)，為次要因素；顯著性分析結果與Plackett-Burman試驗一致。結合直觀分析，正交試驗確定的最優培養基配方為蛋白胨 25 g/L、KH2PO454 g/L和PTM4 1.5 mL/L。

2.2.3 神經網絡模型的建立和應用

2.2.3.1 建立人工神經網絡模型

經證實對于含一個隱含層的3層結構的BP神經網絡，能以任意精度逼近有界區域上的任意連續函數[20]。因此本文以蛋白胨、KH2PO4、PTM4這3個影響因素為輸入神經元，以酶活為輸出神經元，構建N為隱含層的3-N-1型BP神經網絡，結構圖見圖2。

圖2 神經網絡結構圖Fig.2 Structure of artificial neural network

表5正交試驗的9組數據中，其中8組數據作為網絡訓練數據，剩余1組數據作為測試數據。為了提高網絡訓練效率，加快訓練網絡的收斂性，同時防止計算過程中出現“過擬合”等問題，在訓練前對樣本數據進行歸一化處理，使數據全部歸于[0，1]之間，訓練結束后再將輸出還原。本試驗調用Matlab R2018a工具箱中的相應函數進行編程建立BP神經網絡模型并訓練。隱含層節點數選為10，在此條件下該網絡具有足夠的泛化能力和輸出精度，訓練函數為trainlm，隱含層神經元的傳遞函數為tansig，輸出層神經元的傳遞函數為pureline，最大訓練迭代次數為50，其他各項參數選擇默認值。訓練后的網絡收斂于目標誤差0.000 1，滿足精度要求。由此建立了反映發酵培養基中蛋白胨、KH2PO4、PTM4這3個因子與酶活之間非線性關系的BP神經網絡模型。

以網絡預測值和實測值的相對誤差來評價網絡模型，結果見圖3。實測值和預測值的相對誤差絕對值為2%，這表明預測值與實測值有較好的吻合度，訓練后的網絡預測性能好、仿真度高，能夠很好地擬合酶活力與3個影響因素之間的關系。因此該網絡模型可用于對酶活力結果的預測。

圖3 實測值與預測值的比較Fig.3 Comparison of experimental values and predicted values

2.2.3.2 利用BP神經網絡篩選最佳培養基配方

基于所建立的BP神經網絡模型，分別為蛋白胨、KH2PO4、PTM4這3個輸入因素選擇合適的步長，利用Matlab相關函數對每個因素定義域值進行編程，通過sim函數對網絡優化結果進行仿真輸出并找到輸出值最大的組合。結果結果，利用BP人工神經網絡模型進行仿真模擬，在2 783種可能組合中篩選到的最優誘導培養基配方為蛋白胨 23 g/L、KH2PO444 g/L和PTM4 1.5 mL/L。

正交試驗是一種利用部分試驗來代替全面試驗的方法，通過挑選有代表性的試驗點來減少試驗次數[21-22]，但分析得到的結果受限于因素水平的設定；人工神經網絡能夠快速準確地仿真模擬所有試驗條件，避免大量試驗的同時能得出比正交試驗更為精確的結果[23]。

2.2.3.3 驗證試驗

分別按照正交試驗及BP神經網絡優化得到的培養基配方進行3次獨立試驗，測定實際酶活力。正交試驗得到的酶活力為402.64 U/mL，BP神經網絡優化得到的酶活力為402.96 U/mL，與預測值的相對誤差小于2%，說明該BP神經網絡模型可以很好的模擬發酵培養基中蛋白胨等3種組分添加量與酶活力的關系；另一方面BP神經網絡優化得到的培養基配方具有蛋白胨和KH2PO4添加量少的優點，節約發酵成本的同時減少了無機鹽沉淀的產生。人工神經網絡與正交試驗等多種優化方法相結合，能夠反映多因素多水平間復雜的變化規律，在發酵培養基優化方面的應用較廣泛[24-26]。

3 結論

FB1羧酸酯酶在畢赤酵母中的搖瓶水平表達量偏低，本研究首先通過單因素試驗對誘導時間、甲醇體積分數、培養基初始pH、誘導溫度這4個發酵條件進行了優化，綜合考慮發酵成本等實際情況，確定了最適發酵條件即培養基初始pH 6.0，在28 ℃下進行誘導，每24 h補加體積分數為1%的甲醇，誘導96 h。對發酵培養基進行優化，首先采用Plackett-Burman試驗設計快速篩選出蛋白胨、KH2PO4和PTM4這3個因素作為進一步優化試驗的研究對象；采用正交試驗建立數據樣本；利用Matlab R2018a軟件構建3-10-1型BP人工神經網絡模型。得到的最優發酵培養基組成為：蛋白胨 23 g/L、KH2PO444 g/L、PTM4 1.5 mL/L、K2SO47.15 g/L、MgSO4·7H2O 5.85 g/L和酵母粉 5 g/L。通過發酵條件和培養基的優化，酶活力提高了1.19倍，達到402 U/mL以上，同時培養基中無機鹽沉淀大量減少，便于蛋白分離純化等下游環節的進行。本研究為實現畢赤酵母重組菌搖瓶發酵高效生產FB1羧酸酯酶提供了數據參考，下一步將通過高密度發酵優化工藝進一步提高FB1羧酸酯酶的產量，為伏馬毒素酶法脫毒的工業化應用奠定技術基礎。