新疆哈薩克族傳統風干肉中真菌多樣性分析

王俊鋼，李宇輝*，劉成江，郭安民，岳建平

1(新疆農墾科學院 農產品加工研究所，新疆 石河子，832000) 2(農產品加工重點實驗室(新疆農墾科學院)，新疆 石河子，832000) 3(額敏縣新大同創生物工程有限責任公司，新疆 額敏，834699)

風干牛肉是新疆哈薩克族傳統的發酵肉制品，也是山區牧民過冬必備食品[1]。新疆北疆牧區的牧民通常在11月到來年1月制作風干肉，牛肉經過分割切條、腌制后自然風干，制作時間約為2～8個月不等，其產品類型和我國的火腿[2]、土耳其的pastirma[3]和意大利的bresaola[4]相類似。近年來，隨著新疆旅游業的發展，風干肉作為新疆的特色旅游食品，其消費量逐年上升。傳統哈薩克族風干肉的發酵主要依靠天然多菌種混合發酵，包括乳酸菌、微球菌、酵母菌、霉菌等各種微生物[5]，發酵體系中微生物菌群結構復雜，其中真菌所產生的酶可以對肉中的糖類、脂肪和蛋白質進行分解，生成酮醛酯等風味物質提高產品品質、賦予產品特殊的風味和色澤[6-9]。FLORESM等[10]研究發酵香腸發現德巴利酵母菌(Debaryomycesspp.)對成熟過程中揮發性物質的產生有重要影響，通過抑制脂質氧化產物的產生、促進乙酯的生成，可以產生香腸特有的香氣。SIRINE等[11]研究表明青霉菌具有抗氧化、防止酸敗和保持色澤的作用，還可以防止香腸表面形成黏性物質。

傳統食品中的微生物菌落結構更加復雜[12-14]。為了更加清楚地了解傳統發酵食品中微生態體系，可借鑒生態學中對微生物多樣性研究技術和方法[15]。高通量測序技術是微生態學研究方法的一種，能夠快速全面的分析微生物結構復雜的樣品[16]，QUIJADA等[17]使用高通量測序技術對西班牙發酵香腸“Chorizo de León”中微生物菌群多樣性研究發現，不同地區發酵香腸中微生物在亞屬分類等級上有明顯差異；REBECCHI等[18]采用Illumina高通量測序研究豬肉、牛肉和羊肉臘腸中微生物的多樣性，結果顯示不同動物來源的香腸微生物多樣性存在顯著差異。

由于地理環境的差異，使不同來源的風干肉中微生物多樣性有所不同[19]。但目前對新疆風干肉中微生物菌群多樣性還沒有系統的研究，尤其是真菌，其對環境的要求更低，適應性更強，但在風干肉中的群落結構還不清楚，因此很有必要對新疆風干肉中的真菌多樣性進行研究，明確真菌結構組成，為風干肉安全性研究和下一步挖掘專用發酵劑提供理論基礎，同時也可為后期產品的工業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

選取新疆北疆4個哈薩克族聚居的牧區為采樣對象，全部為自然發酵。制作時間都為當年11月份制作的新鮮風干肉，且自然風干時間都為40 d，采集的樣品單獨裝入采樣袋，放在車載冰箱(0～4 ℃)條件下24 h內運回實驗室，存貯在-80 ℃冰箱，備用。詳細分組情況如表1所示。其中采樣地方相同的用相同的大寫字母，數字代表來自于不同的家庭。

表1 樣品來源及分組Table 1 Source and grouping of air-dried meat samples

1.2 試劑

強力土壤?DNA提取試劑盒,美國OMEGA公司；2×TaqMaster Mix (Dye Plus),南京諾唯贊生物科技有限公司；Magnetic Soil and Stool DNA Kit試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司；Axygen凝膠回收試劑盒,Axygen美國；瓊脂糖,西班牙Biowest公司。

1.3 儀器與設備

高速冷凍離心機(Eppendorf 5810R)，德國Eppendorf AG公司；精密電子天平(BSM-220.4)，上海卓精；Bio-Rad電泳儀、PCR儀(T100)、凝膠成像系統(HP1020)，美國Bio-Rad伯樂公司；立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-30KBS)，上海申安醫療器械廠。

1.4 方法

1.4.1 真菌DNA提取與檢測

直接使用DNA提取試劑盒提取樣品中真菌的總DNA。提取方案按照試劑盒說明書進行，每個樣品提取3次，提取的DNA用乙醇沉淀并提純。DNA濃度用分光光度法檢測，之后在1.2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測DNA的完整性。

1.4.2 真多樣性分析

選取真菌的ITS1 區序列進行高通量測序分析。使用PCR儀進行PCR擴增，引物選擇ITS1 區通用引物ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′，擴增出的片段用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠成像系統進行觀察，效果較好的樣本于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，以回收產物為模板進行1次8 循環的PCR 擴增，將Illumina平臺測序所需要的接頭、測序引物、標簽序列添加到目的片段兩端。全部PCR 產物采用Axy Prep DNA 凝膠回收試劑盒進行回收，并用FTC-3000TMReal-Time PCR 儀進行熒光定量，均一化混勻后完成文庫構建，在IlluminaMiSeq 2×300 bp平臺上完成測序。

PCR反應體系為：4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 5 μmol/L Forward Primer，0.8 μL 5 μmol/L Reverse Primer，0.4 μL FastPfu Polymerase，0.2 μL BSA，10 ng Template DNA補dd H2O至20 μL。程序如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性60 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環數為25，72 ℃最終延伸7 min。擴增結束后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物的純度。使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物進行文庫構建后，在IlluminaMiSeq PE 300平臺上進行高通量測序分析。

1.5 數據處理及分析

使用QIIME 中的PyNAST[20]對代表性序列進行比對并去除低質量、接頭污染和低復雜的序列，用FLASH[21]對有效序列進行拼接，根據序列首尾兩端的barcode 和引物序列區分樣品。再用UPARSE[22]軟件將序列聚類到97%的操作分類單位(operational taxonomic unit,OTU)[23]。篩選重復序列，使用Uchime軟件去除嵌合體[24]。所有數據分析使用R語言[25]和Python(https：//www.python.org/)進行。結合熱圖或聚類分析計算物種豐度與環境因子的相關性及其顯著性[26]。

2 結果與分析

2.1 樣品ITS1基因序列質量評估及Alpha多樣性分析

26個樣品測序共獲得 2 059 240對有效的基因序列條帶，平均每個樣品產生35 455條有效序列。為了得到更高質量及更準確的生物分析結果，對雙端 Reads拼接、過濾后共產生1 936 392條優化序列，每個樣品平均產生74 477條優化序列。

根據97%相似性水平下的OTU信息，采用Alpha多樣性指標的Chao1、Ace、Shannon、Simpson 指數以及群落覆蓋度指數Coverage等[27]對樣品中物種豐度和多樣性進行評估，結果如表2所示。所有樣品的OTU覆蓋率為99.98%～100.00%，說明樣品中真菌種類幾乎都能被檢測到，測序結果可以很好的反應樣品中真菌的真實情況。OTU數量越多說明樣品中的真菌豐度越高[28]，由表2可知，樣品G1、G2、J1、J2、L1和L2的OTU數量在100以上，其他樣品中的OTU數量基本都在100以下。這說明G1、G2、J1、J2、L1和L2這6個樣品中真菌種類較多，其中G1、G2、J1、J2源自于富蘊縣，L1和L2屬于巴里坤地區，這可能是由于當地環境所引起的。來源于富蘊縣的4個樣品均采自水草豐富、環境相對較好的牧區，微生物更加容易生長，因此真菌的種類相對較高。來源于巴里坤山區的2個風干牛肉樣品采自牧民家，這可能是和牧民的制作方式有關，衛生條件直接關系到產品中的微生物情況。圖1-a表示真菌群落OTU 數目的Venn
圖，該圖可用于統計多個樣本中共有和獨有的OTU 數目，4組共有的OTU 數目84個，26個樣品種共有的OUT數目僅有13個(圖1-b)，其中塔城(Group1)、額敏(Group2)、富蘊(Group3)和巴里坤(Group4)地區樣品中OTU數目分別為125、133、261和316， Group1和 Group2之間差異不顯著(P>0.05)，其他組之間差異顯著(P<0.05)。

表2 Alpha多樣性指數統計Table 2 Alpha diversity index statistics

稀釋曲線反映了持續抽樣下新OTU(新物種)出現的速率；在一定范圍內，隨著測序條數的加大，若曲線表現為急劇上升則表示群落中有大量物種被發現；當曲線趨于平緩，則表示此環境中的物種并不會隨測序數量的增加而顯著增多(圖2-a)。Shannon指數越大，則表示OTU種類越多，物種越豐富，表明樣品中已涵蓋絕大多數的微生物信息，當曲線趨于平坦時，說明測序數據量足夠大，OTU種類不會再隨著測序量的增加而增加。由圖2-b 可知，對26種風干肉制品中的真菌進行的高通量測序分析表明，當測序量<40 000時，OTU數呈明顯上升趨勢，表明此時仍未檢測到更多種類的菌種。當測序數量逐漸增加時，樣品的OTU數量增加，但趨勢趨于平穩。當測序深度達到60 000時，所有樣品的OTU變化均趨于平穩。隨著測序量的增加，真菌的多樣性幾乎不變，這表明現有的測序量已經可以反映樣品中真菌的豐度信息。采用隨機抽樣的方法對序列進行測序，以繪制出繪制的序列數和可代表的OTU數的曲線。即可知多數樣本在序列數接近60 000時，OTU已經接近飽和，說明現有測序量已經可以反映出樣品中真菌豐度信息。

圖1 樣品中真菌群落OTU的Venn圖Fig.1 Venn diagram of OTU of fungal community in samples

圖2 樣品稀釋性、Shannon指數曲線Fig.2 Sample dilution and Shannon index curve

2.2 不同來源風干肉中真菌群落組成分析

根據分類學分析結果，可以得到不同樣品在不同分類水平上的群落組成情況。圖3-a表示的是在門水平下，樣品中真菌豐度在0.1%以上的真菌用群落組成表示，豐度<0.1%的真菌用Other表示。由圖3-a可知，樣品中的優勢真菌門有子囊菌門(Ascomycota)73.13%、擔子菌門(Basidiomycota)24.77%和被孢霉菌門(Mortierellomycota)2.76%。這3個菌門真菌含量占到測序序列總數的99%。不同地區風干肉中真菌主要優勢菌群略有差異，塔城地區優勢真菌門為Basidiomycota，占該組真菌菌群的50.65%，而其他3個地區(額敏、富蘊、巴里坤)主要優勢真菌門為Ascomycota，分別占該組真菌菌群的70.33%、85.65%和80.47%。高慶超等[29]研究發現，同屬于自然發酵的黑果枸杞酵素，通過高通量測序在門分類水平下，子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)占整個真菌門水平的99%。陳新[30]在對新疆新疆天山雪嶺土壤中微生物種群的研究中也發現，土壤真菌中被孢霉菌門(Mortierellomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)的相對豐度約占總和的70%，屬于優勢種群。以上結果可以看出，雖然研究對象不同，但真菌群落結構和優勢菌群的差異不大，這是因為自然發酵產品中的微生物主要來自于當地的土壤、空氣和水，在門的分類水平上來看，自然發酵食品的真菌類型和土壤當中的真菌基本一致。

圖3 各樣品在門、屬水平下真菌群落結構分布Fig.3 Relative abundance of the major fungus phylum and genus in samples

不同樣品中真菌在分類屬水平上的分布情況如圖3-b所示。在26份風干肉樣品中共鑒定出32個屬，相對含量>1%的10個屬分別為假絲酵母屬(Candida) 30.09%、Mrakia16.26%、Unclassified15.82%、德巴利酵母屬(Debaryomyces)11.14%、球腔菌屬(Mycosphaere)6.37%、青霉屬(Penicillium)4.23%、曲霉屬(Aspergillus)2.39%、(Mrakiella)2.88%、Naganishia1.71%和維希尼克氏酵母(Vishniacozyma)1.55%。其中，塔城牛肉(A1、A2)相較于其他幾個樣品所含真菌屬比較單一，優勢真菌屬為Mrakia，占到85%左右。額敏牛肉(F1、F2)和托里牛肉(K1、K2)在真菌屬組成較為相似。不同地區風干肉中真菌主要優勢菌群不同，樣品塔城牛肉(C1、C2)中優勢真菌屬為青霉屬(Penicillium),占40%左右;樣品富蘊牛肉(G1、G2)中優勢真菌屬為德巴利酵母屬(Debaryomyces),占60%左右;樣品巴里坤馬肉(M1、M2)中優勢真菌屬為球腔菌屬(Mycosphaere),占65%左右。不同地區真菌在屬水平上有著一定差異(圖4-b)，塔城地區和額敏地區菌群結構及種類比較類似，這可能是由于塔城和額敏都屬于塔額盆地，地理環境和氣候都比較類似。其他2個地區樣品中真菌多樣性則更加豐富，可能是由于這2個地區都屬于山區牧區，降水量多，物種相對豐富，因此，菌群多樣性也更加豐富。

a-門水平;b-屬水平圖4 四組樣品在門、屬水平下真菌群落結構分布Fig.4 Relative abundance of the major fungus phylum and genus in four groups of samples

有研究表明，漢遜德巴利酵母(Dabaryomyces)和假絲酵母(Candida)是發酵肉制品的生產中最常用的酵母菌[31]，因為其可促進發酵香腸的呈色，改善發酵香腸的風味，另外，有些酵母菌還能抑制腐敗菌的滋生[32]，趙永強等[33]用米曲霉和魯氏酵母對合浦珠母貝肉進行發酵發現，其可以有效改善產品風味及游離氨基酸含量。另外，文開勇等[34]對四川傳統臘肉研究發現，曲霉屬(Aspergillus)為四川臘肉中優勢真菌屬。發酵肉在長時間的發酵過程中，真菌的生長繁殖可以產生多種酶類化合物，將肉中大分子的蛋白質、脂肪分解成小分子的醇酮醛等化合物，并能增加氨基酸的種類和游離脂肪酸的形成，促使亞油酸轉化成共軛亞油酸，有利于風干肉中特殊風味的形成，顯著提升發酵肉的風味品質和營養價值[35]。另外，酵母菌和霉菌還可以促進發酵肉中乳酸菌的生長，加速肉制品中水分含量的降低，并且能夠降低風干肉的酸度，抑制發酵肉中脂質氧化、過氧化物的生成及腐敗微生物生長繁殖，從而提高風干肉的安全性能[36-37]。本實驗中優勢的真菌屬有假絲酵母屬(Candida,30.09%)、德巴利酵母屬(Debaryomyces,11.14%)和曲霉屬(Aspergillus,2.39%)，說明這3個屬的真菌在風干肉的發酵過程中屬于優勢菌群，對風干肉品質形成有一定的影響。

為了能夠更加直觀的看出不同來源不同樣品之間真菌屬水平的相似程度，通過物種豐度聚類熱圖(Heatmap)表示(圖5)。Heatmap是一顏色梯度來代表數據矩陣中數值的大小，并根據物種豐度相似性進行聚類，將高豐度和低豐度的物種分類聚集，通過顏色梯度及相似程度反映多個樣品群落組成的相似性和差異性。由圖5可知，在真菌屬水平，Group1、Group2、Group3和Group4中樣品的聚類分析結果相互交叉，并有差異，其中L2、J2和D1樣品和其他樣品的群落組成差異較大，剩下的其他樣品之間菌群聚類結果比較相似。

圖5 樣品在屬水平物種豐度聚類熱圖Fig.5 Cluster heatmap of species abundance at genus level

26個樣品都屬于哈薩克族傳統手工制作，其中4個是馬肉，22個是牛肉，全部沒有添加發酵劑，都屬于自然發酵，但由于制作地區環境、風干溫度以及制作人員的操作不同等原因導致了不同樣品的真菌群落組成差異。實驗結果表明，風干馬肉和風干牛肉菌群多樣性差異不大。從PCoA圖可以看出(圖6)，26 個樣品的真菌群落組成大致可以分為2 個類型，其中Group1和Group2樣品分布相對較集中，說明這2組樣品真菌群落結構比較相近，這與圖5的結果相互印證。Group3和Group4組中樣品分布在2個不同的位置，且相互之間距離較遠，其中Group3組中J1、J2和G1、G2分別來自于富蘊的牧區，而其他樣品則是山區，地理環境造成了其真菌菌群的差異。Group4組中K1、K2和其他樣品真菌群落差異較大則是因為L1、L2和M1、M2采自于臨近村落的2種不同的原料肉，而K1、K2則是采自于另外較遠的村莊。

3 結論

本研究采用IlluminaMiSeq第二代測序技術研究了新疆北疆4個地區26個傳統風干肉中真菌多樣性，并結合高通量測序結果揭示了風干肉中真菌的多樣性，不僅可以檢測到可培養的真菌，而且還檢測出了大量的不可培養真菌，尤其是對自然發酵肉制品，可以更加全面的反應樣品中的菌群多樣性。

高通量結果表明，4組26 個樣品測序共獲得真菌原始序列 2 059 240條，過濾后得到的有效序列為 1 936 392 條。26份風干肉樣品中真菌在真菌分類門水平上共鑒定出5個門，平均豐度值>1%的3個真菌門分別為：子囊菌門(Ascomycota，73.13%)、擔子菌門(Basidiomycota，24.77%)和被孢霉門(Mortierellomycota，2.76%)。這3個菌門真菌含量占到測序序列總數的99%。不同地區風干肉中真菌主要優勢菌群不同，塔城地區優勢真菌門為Basidiomycota，而其他3個地區(額敏、富蘊和巴里坤)主要優勢真菌門為Ascomycota。另外，在26份風干肉樣品中共鑒定出32個屬，相對含量>1%的屬分別為假絲酵母屬(Candida，30.09%)、Mrakia16.26%、德巴利酵母屬(Debaryomyces，11.14%)、球腔菌屬(Mycosphaere，6.37%)、青霉屬(Penicillium，4.23%)、曲霉屬(Aspergillus，2.39%)、(Mrakiella) 2.88%、Naganishia1.71%和維希尼克氏酵母(Vishniacozyma,1.55%)。豐度聚類熱圖和Beta多樣性分析表明，L2、J2和D1樣品和其他樣品的群落組成差異較大。