自制酵素中乳酸菌群動態分析及對重金屬的吸附積累特性

石佳佳，齊天翊,2，張萌，陳淋霞，張笛，包智華*

1(內蒙古大學 生態與環境學院，內蒙古 呼和浩特，010021) 2(呼和浩特市回民區環境衛生管理所，內蒙古 呼和浩特，010021)

隨著工業的發展，重金屬污染日趨嚴重。由于環境中的重金屬可以通過生物富集作用進入農產品中，危害人體健康，所以解決食品中重金屬污染問題十分重要。鉛(Pb)、鎘(Cd)作為被聯合國糧農組織(Food and Agriculture Organization，FAO)和世界衛生組織(World Health Organization，WHO)確認的對人體毒性最強的2種重金屬，廣泛分布于自然界中，其污染可通過食物鏈傳播[1]。如何有效去除食品中的Pb、Cd污染已經引起廣泛關注。對比傳統的物理化學方法，用微生物去除食品中的重金屬更加經濟高效，且前景廣闊[2]。

在各類食品中，尤以谷物類和蔬菜類食品中Pb、Cd的健康風險值最高[3]。殺蟲劑等農藥的使用及土壤中該類重金屬含量超標都會提高蔬菜、水果中的Pb含量，對人體產生潛在危害。酵素是以新鮮蔬果、植物等為原料，經乳酸菌、酵母菌等有益菌發酵而成的功能性產品，富含酶、維生素、礦物質等營養成分[4]。酵素中的微生物是酵素發揮一系列功能的主要原因，能夠抑制有害菌、改良土壤結構、增加作物產量，從而生產對環境無害的產品[5]。韋文芳等[6]通過將自制酵素噴灑在農作物上明顯提高了氧化樂果、毒死蜱等5種農藥的降解作用。部分乳酸菌可以吸附積累食品中的重金屬[7-8]，而酵素中含有大量的乳酸菌，因此酵素在去除食品重金屬污染方面也有很大應用潛力。傅亞平等[7]利用植物乳桿菌(Lactobaciliusplantarum)和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)復合發酵有效去除了大米中85.73%的Cd。從中國傳統泡菜中分離出的L.plantarum70810 EPS具有較好的鉛吸附效果[8]。利用酵素中存在的乳酸菌等復合微生物不但可以去除果蔬、土壤中的重金屬，這些有益菌也可以避免微生物修復后的殘留污染，對人體無害，安全性高。水果酵素是由較常見的、價格低廉且原材料容易獲取的水果發酵而成，農戶可以自行制作，直接將酵素噴灑到種植蔬菜、農作物的土壤中達到去除部分重金屬污染的目的。但是，目前對于水果酵素發酵過程中細菌群落結構，尤其是乳酸菌群動態變化的研究較少。為此，本文將水果、蔬菜及植物進行搭配發酵，以2種自制酵素為研究對象，利用高通量測序技術對不同發酵時段酵素樣品中微生物群落結構動態進行分析和比較；對酵素樣品中優勢乳酸菌進行分離，并測定代表性菌株的Pb2+和Cd2+耐受性以及吸附和積累量。以期實現利用酵素中微生物去除食品中的重金屬污染。

1 材料與方法

1.1 自制酵素樣品制備

自制酵素樣品AA以m(蘋果)∶m(橘子)∶m(米糠)=4∶4∶1為原料，按m(水)∶m(糖)∶m(原料)=10∶1∶3配制；AB以m(蘋果)∶m(橘子)∶m(圓蔥)∶m(艾草)∶m(米糠)=3∶3∶1∶1∶1為原料，按m(水)∶m(糖)∶m(原料)=10∶1∶3配制。原料搗碎與糖、水混合均勻，室溫自然發酵，每天攪拌1次。在發酵4個時段(10、20、40和120 d)取樣進行測序。

1.2 自制酵素樣品細菌群落高通量測序

利用細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取各時段酵素樣品中菌體DNA，通過高通量測序Hiseq-PE250平臺進行細菌16S rRNA V3-V4區域擴增子測序分析?；贗llumina HiSeq測序平臺，利用雙末端測序(Paired-End)方法，構建小片段文庫進行測序。通過對Reads拼接過濾，操作分類單位(operational taxonomic unit,OTU)聚類，進行物種注釋及豐度分析。

1.3 自制酵素中乳酸菌的分離及系統發育分析鑒定

用于分離乳酸菌的乳酸菌培養基(MRS，g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，檸檬酸氫二胺2，葡萄糖20，吐溫80 1 mL，乙酸鈉5，K2HPO42，MgSO40.58，MnSO40.25，瓊脂18，定容至1 L，pH 6.2～6.6。121 ℃滅菌20 min。

用TIANamp Bacteria DNA Kit提取純菌株總DNA。用引物27F和1492R[9]擴增16S rRNA基因，擴增體系：25 μL體系，DNTP Mix(2.5 mmol/L)2 μL，10×TaqBuffer 2.5 μL，ddH2O 17.3 μL，引物27F和1492R各1 μL，Taq(5 U/μL，TaKaRa ExTaqTM) 0.2 μL，模板DNA 1 μL；擴增反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，26～30個循環；72 ℃后延伸10 min，擴增片段約1 500 bp。PCR產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至美吉桑格生物醫藥科技有限公司測序，測序結果與GenBank上已知序列進行比對，利用MEGA7軟件中的鄰接法(neighbor-joining analysis)構建系統發育樹。

1.4 分離菌株的重金屬耐性研究

在重金屬Pb2+、Cd2+脅迫條件下測定分離菌株的生長曲線及最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)[10]，判斷菌株對Pb2+、Cd2+耐受性。

(1)重金屬原液配制：將CdCl2·2/3H2O、Pb(NO3)2分別溶于超純水中配制成Pb2+、Cd2+金屬原液。121 ℃滅菌20 min，4 ℃保存。

(2)設置Pb2+和Cd2+金屬培養液梯度為50、100、200和300 mg/L，同時設置一組不加重金屬的空白對照。每個質量濃度設3個平行。將MRS液體培養基分裝到試管中，121 ℃滅菌20 min。冷卻至室溫后加入相應濃度重金屬原液。

(3)分別移取3種菌株原液加入到液體培養基中，接種量1%(體積分數)，30 ℃搖床恒溫培養。

(4)培養一定時間后分別取樣，測定菌液樣品OD600值。

1.5 分離菌株的重金屬吸附與積累測定

通過用EDTA洗脫細菌細胞表面吸附的重金屬，初步分析重金屬吸附率[11]；洗脫后用HNO3溶液消解分析菌體內重金屬積累量。

(1)配制100 mg/L Pb2+金屬培養液，設3個平行，測定初始質量濃度ρ0。加入體積分數1%菌體原液，30 ℃培養。

(2)將培養后的菌液混勻離心，取上清液到新離心管中，測定其質量濃度(ρ)。

(3)向菌體沉淀樣品中加入5 mL EDTA洗脫液(0.5 mol/L，pH 8)，混勻使充分洗脫后離心，移取洗脫液至新離心管中待測。重復此步驟4～5次，直至菌株表面金屬離子徹底洗脫。

(4)將洗脫后菌體沉淀放于80 ℃烘箱烘干至恒定質量，稱量菌體干質量m干。向干燥菌體中加入4 mL 體積分數60% HNO3溶液進行消解，80 ℃水浴3 h；冷卻至室溫后加入500 μL H2O2，90 ℃水浴1 h。將消解液轉移到新離心管中，用1% HNO3溶液補足至5 mL[6]。測定其質量濃度(ρ2)。

(5)將所有待測樣品用0.22 μm濾膜過濾后用原子吸收光譜儀(iCETM3300 AAS，美國Thermo Fisher)測定金屬離子質量濃度。

(1)

(2)

式中：β，金屬離子去除率，%；ρ0，溶液初始金屬離子質量濃度，mg/L；ρ，加菌培養后金屬離子質量濃度，mg/L；ω，菌體內金屬離子積累量，mg/g；ρ2，消解樣品金屬離子質量濃度，mg/L；V，待測消解液體積，L；m干，菌體干質量，g。

試驗數據采用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，對各菌株間去除率或積累量進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 自制酵素中細菌群落結構動態分析

2.1.1 Alpha多樣性分析

高通量測序共獲得230 940條有效序列，其中10、20 d有效序列共87 374條，共劃分923個OTU；40 d為67 517條，共劃分624個OTU；120 d為76 049條，共劃分2 775個OTU。8個樣品Coverage都在0.995以上，說明本次測序結果能較真實地反映微生物群落情況(表1)。2個發酵樣品120 d時Observed species、Shannon、Simpson和Chao1指數最高，而20 d時最低。表現出發酵時間越長細菌群落多樣性越高的趨勢，但是2種發酵樣品同一時段多樣性指數有所差異，說明酵素樣品原料配比差異性會誘導細菌群落多樣性的不同。

2.1.2 酵素樣品細菌群落多樣性相對豐度分析

門水平細菌群落相對豐度分析結果如圖1-a。以厚壁菌門(Firmicutes)為主(豐度>57%)，其次是變形菌門(Proteobacteria)(豐度<16.8%)。與其他時段相比，發酵20 d時厚壁菌門相對豐度最大為97.7%。發酵120 d時厚壁菌門相對豐度降至4個時段最低，為58.1%；此時變形菌門(16.6%～16.8%)、放線菌門(Actinobacteria)(4.9%～5.7%)等其他菌門相對豐度最大，細菌群落多樣性最高(表1)。

表1 酵素中細菌群落Alpha多樣性指數Table 1 The bacterial community Alpha diversity index of the Jiaosu samples

屬水平細菌群落相對豐度分析結果如圖1-b。2個樣品中菌群變化大致相同，其中乳酸桿菌屬(Lactocacillus)在4個發酵階段相對豐度均占優勢(25.8%～70.9%)，發酵20 d時豐度最高達70.9%。此外，發酵10～40 d時相對豐度較高的有魏斯氏菌屬(Weissella)(4%～36.2%)、片球菌屬(Pediococcus)(8.4%～25.4%)和明串珠菌屬(Leuconostoc)(1%～23.2%)，120 d后3種菌屬相對豐度明顯下降。

a-門水平；b-屬水平圖1 細菌群落相對豐度分析Fig.1 Analysis of relative abundance of bacterial community

2.1.3 酵素樣品部分乳酸菌及致病菌不同時段相對豐度分析

為了解不同發酵時段種水平乳酸菌和大腸桿菌等的變化，進行了進一步詳細分析。酵素中部分乳酸菌和致病菌菌群相對豐度變化如圖2所示。2組樣品在發酵10 d時戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)和戊糖片球菌(P.pentosaceus)相對豐度分別為23%和18%，是優勢乳酸菌。發酵20 d時戊糖乳桿菌豐度急劇上升至65.5%，而大腸桿菌(Escherichiacoli)豐度較初期(2.1%)急劇下降至0.14%。發酵40 d時戊糖乳桿菌和戊糖片球菌豐度急劇下降，而假腸膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)、棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)成為優勢乳酸菌，3者共同豐度最高可達42.9%。隨著發酵時間延長假腸膜明串珠菌豐度下降，到120 d時2種樣品中只剩棒狀乳桿菌和干酪乳桿菌。同時，金黃色葡萄球菌數量逐漸增多。可見不同發酵時期種水平乳酸菌和致病菌相對豐度有明顯變化。

圖2 酵素中部分乳酸菌、致病菌菌群相對豐度變化Fig.2 Relative abundance of some lactic acid bacteria and pathogenic bacteria in Jiaosu

如圖3所示，2組酵素樣品在發酵120 d內pH一直保持在酸性條件(pH<4.5)。且隨著發酵時間延長pH緩慢增加。當發酵10～20 d時pH值在3以下，而40～120 d時pH達3.5～4.05，同時乳酸菌和致病菌豐度也發生明顯變化(圖2)。發酵前20 d(pH 3.3)時乳酸菌豐度最高，致病菌豐度最低；發酵120 d(pH 4左右)時乳酸菌豐度減少且種群發生變化，致病菌有增長趨勢。

圖3 酵素樣品AA、AB不同時段pH測定Fig.3 pH measurement of Jiaosu samples AA and AB in different periods

2.2 自制酵素中分離乳酸菌菌株的系統發育分析

通過分離純化共得到39株菌種，包括32株乳酸桿菌(Lactobacillus)和7株片球菌(Pedicoccus)。將菌株16S rRNA序列與NCBI數據庫比對，構建系統發育樹如圖4。39株菌共聚類分成6簇。類群Ⅰ(17株)、Ⅱ(2株)、Ⅲ(8株)、Ⅳ(AB13)、Ⅴ(7株)和Ⅵ(4株)分別近緣于短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、布氏乳桿菌(L.buchneri)、戊糖乳桿菌(L.pentosus)、牛痘乳桿菌(L.vaccinostercus)、酒窖片球菌(Pediococuscellicola)和棒狀乳桿菌(L.coryniformis)。所有分離菌株與親緣菌的16S rRNA基因相似度均達99%以上。基本成功分離了不同發酵時段的關鍵乳酸菌。

圖4 基于菌株16S rRNA序列構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on strain 16S rRNA sequence

2.3 分離菌株重金屬耐性分析

選取發酵過程中主要菌群的3株代表菌：短乳桿菌AA1、戊糖乳桿菌AA11和酒窖片球菌AA12，測定其在MRS液體培養基(pH 6.5)，重金屬Pb2+、Cd2+脅迫條件下的生長曲線得出：3株菌在Pb2+脅迫條件下(圖5-a)表現出較強耐受性，在300 mg/L Pb2+條件下均生長良好；而在50 mg/L Cd2+脅迫條件下(圖5-b)其生長明顯受到抑制。將多次測定OD值沒有增長變化的重金屬離子濃度作為MIC，可知：菌株AA1、AA11和AA12對Pb2+的MIC>300 mg/L；對Cd2+的MIC<100 mg/L。

a-Pb2+；b-Cd2+圖5 Pb2+、Cd2+脅迫條件下3株菌最高相對生長量Fig.5 The maximum relative growth of 3 strains under Pb2+,Cd2+ stress

2.4 分離菌株對Pb2+的吸附與積累測定

為進一步了解分離菌株對重金屬Pb2+的吸附和積累特性，選擇發酵20 d時3株代表菌株AA1、AA11和AA12進行Pb2+生物吸附及體內積累量測定。根據最終濃度繪制3株菌對Pb2+的去除率和體內積累量(圖6)。樣品初始Pb2+質量濃度為98.73 mg/L，將菌株AA1、AA11和AA12對數生長期菌液離心得上清液質量濃度分別為39.65、21.25和43.80 mg/L，得出對Pb2+去除率分別為59.84%、78.47%和55.63%。為分析細菌細胞內Pb2+積累量，洗脫菌體5次至Pb2+濃度在檢測線以下(≤1%)。洗脫細胞外重金屬后用HNO3溶液消解干菌體，最終得出3株菌體內Pb2+積累量分別為1.59、2.13和1.36 mg/g(DW)。其中，菌株AA11對Pb2+的去除率和積累量明顯高于菌株AA1和AA12(P<0.05)。

圖6 三株代表菌對Pb2+的去除率和體內積累量Fig.6 Removal rate and accumulation of Pb2+ by three representative strains 注：不同字母表示菌株間去除率或積累量差異顯著(P<0.05)

3 結論與討論

發酵成分有所差異的發酵液在發酵過程中總體細菌群落變化基本一致，說明發酵成分對乳酸菌富集過程影響不大。但不同時段菌種發生明顯變化，當發酵20 d時乳酸菌屬占絕對優勢(圖1)，這與高慶超等[12]在黑果枸杞酵素發酵過程中的結果一致。此時戊糖乳桿菌(61.6%～65.2%)成為優勢菌群，且群落結構多樣性相較于其他3個時段最低，這可能是由于乳酸桿菌等乳酸菌產生的乳酸在抑制雜菌生長的同時，較強酸性生境條件(pH 3.2，圖3)富集了乳酸菌[13]。且該時段致病菌等雜菌明顯受到抑制(圖2)，故為發酵最優時段。戊糖乳桿菌生存環境pH 3左右時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有害菌的抑制效果最好[14]；其他乳酸菌，如戊糖片球菌、短乳桿菌(L.brevisATCC 14869)、布氏乳桿菌、植物乳桿菌等均能抑制致病菌和菌毒素[15-21]。上述結果支持了本研究中關于發酵20 d是乳酸菌相對豐度占比最大時段且大腸桿菌等明顯受到抑制的現象。在發酵40～120 d時微生物多樣性明顯上升(圖1)，其他菌群豐度增加，而戊糖乳桿菌和片球菌也被假腸膜明串珠菌、棒狀乳桿菌和干酪乳桿菌所取代且總體豐度降低(圖2)。這可能是由于發酵液pH上升(圖3)，其他菌群開始生長并競爭營養物的能力比乳酸菌強且逐漸抑制其生長所致。此階段大腸桿菌生長持續被抑制，但金黃色葡萄球菌在發酵120 d時表現出生長趨勢(圖2)，說明戊糖乳桿菌對致病菌的抑制作用比其他乳酸菌強。在重金屬耐性實驗中，3株代表菌AA1、AA11、AA12在高濃度Pb2+脅迫條件下表現出較強耐受性。這與張利[22]分離的乳酸菌在Pb2+脅迫條件下MIC >400 mg/L結果相對應。相比于Pb2+，3株菌對Cd2+耐受性表現較差(圖5)，可能是由于Cd2+濃度過高導致細胞的微觀結構受到破壞[23]。在吸附積累實驗中，3株優勢乳酸菌代表菌株均具有較好的Pb2+去除能力(>55.63%)，其中戊糖乳桿菌AA11對Pb2+去除能力明顯強于短乳桿菌AA1和酒窖片球菌AA12(P<0.05)(圖6)，表明乳酸菌菌種間有差異，且暗示了自制酵素具有較好的去除Pb2+的潛力。同時有研究表明乳酸桿菌主要通過其細胞壁表面的表層蛋白或官能團吸附重金屬離子[24-26]，穩定性好[27]且對腸道Pb2+毒性有緩解作用[28]。

本文不僅研究了乳酸菌等有益菌群的動態變化，還對大腸桿菌等致病菌群進行了相對豐度分析；同時得出在發酵20 d時乳酸菌相對豐度最高且能抑制大腸桿菌等有害菌，是最適合的發酵期；戊糖乳桿菌作為優勢乳酸菌對Pb2+具有較強的耐性和去除作用，在食品重金屬去除領域有潛在應用價值。對于酵素在鉛污染環境中的實用性需進一步探索。