細胞培養肉的挑戰與發展前景

鄭歐陽,孫欽秀*,劉書成*,魏帥,夏秋瑜,潘燕墨,劉陽,楊作苗,王新

1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東 湛江,524088)2(廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東 湛江,524088)3(廣東省海洋食品工程技術研發中心,廣東 湛江,524088)4(廣東省海洋生物制品工程重點實驗室,廣東 湛江,524088)5(海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心,大連工業大學,遼寧,大連,116034)

隨著經濟的發展,生活水平的提升,人們對飲食的需求從“吃得飽”向“吃得好”轉變,食品的營養健康越來越受人們重視,肉類作為人們日常飲食中蛋白質的主要來源之一,是現代人餐桌上必不可少的食物。然而,世界人口不斷增加,加劇了肉類需求的增長。2018年8月之后,隨著非洲豬瘟肆虐,豬肉供應量銳減,導致整體肉類價格急劇飆升,肉類生產成為人們關注的焦點之一。然而,傳統畜牧業存在生產效率較低,生產中會產生大量的CO2、CH4以及NO2等廢氣,并存在占用大量土地以及水資源和能源的大量消耗等問題[1]。此外,養殖畜禽肉還存在抗生素、獸藥殘留超標,人畜共患病等公共安全衛生隱患[2]。肉類需求的增長、環境的極限承受能力以及公共安全衛生隱患等,為人造肉的產生發展創造了機會和條件[3]。人造肉相比傳統畜牧肉具有高效節能、衛生安全、環境友好、動物減負等可持續性特點,受到了人們的廣泛關注[4]。

人造肉根據其生產形式可分為兩類,一類是以植物蛋白為基礎的植物基肉,另一類是以細胞培養技術為基礎的培養肉[5-6]。美國上市公司Beyond Meat以植物蛋白為原料生產植物基肉，一經上市就吸引了大量資本的投入,與肯德基合作推出的素食炸雞首次上市僅5 h即售罄,可見消費者對人造肉有一定的需求和接受基礎。然而,植物基肉在顏色、味道、口感以及營養成分等方面與傳統肉還存在很大的差距。1932年WINSTON首次提出細胞培養肉的概念,但受到各方面限制,其發展速度緩慢[4]。2013年8月,荷蘭馬斯特里赫特大學的科學家在倫敦展示了第1個由實驗室培養的牛肉漢堡[7],展示的漢堡不僅在顏色、外形與真的漢堡很相似,在味道上與真正的漢堡差異也很小,經過2年的發展,人造漢堡肉餅的成本已由32.5萬美元降到了11美元左右,且隨著技術的發展生產成本仍有大幅度降低空間,這增加了人們對培養肉商業化的信心[8]。細胞培養肉是通過提取可高效增殖的干細胞或組織,放入培養皿中增殖,進而分化成肌肉組織的原始纖維而形成的肉[9]。其在營養、口感和風味方面更接近真實肉制品,是未來人造肉的主要研究發展方向。然而,目前細胞培養肉的研究尚處于起步階段,其在規?；虡I化的道路上還有許多技術性難題需要解決。本文通過對細胞培養肉的研究現狀、規?；c市場化面臨的技術問題進行了闡述,并對其可能的解決策略和發展前景進行了探討。

1 細胞培養肉的研究現狀

目前以細胞培養為基礎的動物組織工程研究在生物學和醫學方面得到了廣泛應用,而細胞培養技術在規模化培養肉生產中的應用卻鮮見報道,組織工程的研究為細胞培養肉大規模生產奠定基礎,提供了可行性方案。在20世紀50年代白鼠的成纖細胞以及白鼠的腎臟細胞已經成功應用到醫學的毒理學研究。直到2002年,科學家BENJAMINSON及其團隊從金魚細胞中培養出了可食用的肌肉蛋白,細胞培養肉才得以開展研究[10]。近年來美國和荷蘭投入了大量資源開展相關研究,已經取得了突破性進展。美國南卡羅來納醫科大學的研究人員從火雞中提取肌細胞,并將細胞培養于牛血清營養液中,得到了條型的火雞肉[11],但由于缺乏脂肪及血液供應,培育出的火雞肉口感較差。荷蘭馬斯特里赫特大學的POST教授利用成肌干細胞培養實現了人造牛肉漢堡在實驗室層面上的生產[12]。2019年3月,日本著名的食品企業日清食品控股公司宣布與東京大學合作,通過人工培育牛肌肉細胞成功制成約1 cm3的肌肉組織[13]。南京農業大學周光宏教授團隊使用豬肌肉干細胞培養20 d后,獲得了中國第1塊質量為5 g的細胞培養肉[14]。關于細胞培養肉的專利目前國內相對較少,主要細胞來源有禽類、魚類、家畜類以及小鼠和人類的肌細胞?？傮w來說,關于細胞培養肉相關研究的報道還較少,且集中在細胞培養與誘導分化上[13]。目前的細胞培養主要是針對疾病治療的醫學研究以及動物育種,僅能在實驗室進行少量的培養。

2 細胞培養肉面臨的培養技術挑戰

細胞培養肉的生產是離體細胞(種子細胞)在適宜的培養環境中(培養基),如溫度、氧氣、營養物質和生長因子,通過生長增殖形成多核肌管,肌管成熟后形成肌肉纖維,肌肉纖維進一步生長最終成為一種模仿肉的產品。細胞培養過程中的種子細胞選擇、細胞增殖與分化、培養基種類、反應器和支架系統等關鍵點是限制其規?；囵B的重要環節。

2.1 種子細胞選擇

在細胞組織培養過程中,種子細胞的選擇一直是研究的重點和難點之一[6]。理論上種子細胞的選擇范圍非常廣泛,無論是豬、牛、羊等哺乳動物細胞,雞、鴨、鵝、魚、昆蟲等非哺乳動物,還是其他任何可食用的動物細胞,只要具有可靠的健壯連續細胞系,都可以在規模反應器中培養動物肌肉或器官細胞生產肉類。然而如何獲得大量均一種子細胞并進行持續高效穩定地增殖分化,并實現規?；a仍然面臨著嚴峻的挑戰[15]。

目前,動物組織工程研究中主要使用2種種子細胞。一種是以原始組織或細胞株為原料,利用基因工程或化學物理方法誘導突變,篩選無限增殖細胞。持續增殖的細胞可以減少對新鮮組織樣本的依賴,增加細胞增殖和分化的速率。該過程通常是通過表達病毒癌基因、端粒酶逆轉錄以及兩者結合使用來實現,然而培養過程中的基因表達以及逆轉錄過程易發生識別錯誤,進而導致遺傳和表型不穩定[16]。此外,通過基因工程對細胞進行無限增殖培養可能會造成染色體不穩定,比如在傳代之后造成不可逆的關鍵基因或者性狀的丟失。目前,雖然轉基因植物產品正在逐步被大眾所接受,但是轉基因動物細胞培養仍存在未知的風險,其食用安全性也是限制其發展的重要因素。另一種來源是從組織中分離出干細胞,如胚胎干細胞、肌肉干細胞或間充質干細胞。從理論上講,各種干細胞可以無限增殖,但是在增殖過程中細胞突變的積累往往會影響擴展能力,造成細胞衰老。目前科研工作者從細胞自身基因和外界刺激因素,尋找方法培育可以長期傳代培養、無限分裂增殖的細胞系[15]。YANG等[17]以豬成肌細胞為試驗材料,成功誘導成肌細胞分化為肌管。王紅娜等[18]采用膠原蛋白酶I消化綿羊胎兒細胞分離成肌細胞,成功地獲得了高純度綿羊成肌細胞系。陳凱凱等[19]利用I型膠原酶消化雞胚胸肌,成功分離培養了肉雞成肌細胞。周學亮等[20]誘導重編程三黃雞體細胞,優化了誘導多功能干細胞的培養條件,使體細胞保持良好的生長狀態。但誘導多功能干細胞目前仍處于起步階段,存在誘導成功率低,誘導細胞純度低以及基因漂移等問題。

2.2 細胞增殖與分化

細胞增殖的目的是使種子細胞獲得最大的細胞數量,即最大限度地增加細胞的增殖倍數。細胞培養肉的生產需要細胞大量高效的增殖才能獲得足夠多的產品。為保證肉類生產的安全性和高效性,在細胞培養生過程中,需要嚴格控制成千上萬的變量,這些變量會直接影響到種子細胞的增殖。目前最大的挑戰是定義每一個變量的水平,例如營養液的成分比例、生理生化條件等,以及各變量之間的相互作用[21]。這些變量以及變量之間的相互影響主要是通過反復實驗獲得,隨著研究的進行,生產細胞培養肉的系統方法逐步建立完善。

研究已經證實,通過體外補充營養液,可以維持細胞正常的生長繁殖以及有限次數的增殖,然而要維持細胞多次的傳代分裂仍然面臨著巨大挑戰。不同的種子細胞的體外增殖能力不同,利用理化刺激、基因突變、病毒感染等外界刺激促使細胞體外無限增殖的不衰老細胞株建立永生化細胞系[22]。通過誘導多能干細胞,可以誘導體細胞的重編程而獲得可不斷自我更新且具有多向分化潛能的細胞,從而實現類似于胚胎干細胞的無限增殖[23]。大多數成體干細胞分裂能力是有限的,生理條件下的細胞增殖極限(海弗里克極限)是50～60次,但實際上體外培養的細胞遠遠達不到這個分裂潛能[6]。突破細胞增殖限制是增強細胞持續增殖的有效途徑。

細胞培養肉不僅需要大量的細胞數量,還需要大量分化的肌肉細胞來形成組織。為了更好的模擬真實肉類的結構,HOCQUETTE等[22]通過肌肉細胞和脂肪細胞共同培養發現：通過調節細胞生長環境調控脂肪細胞的含量,可以控制肉類的紋理。因此,通過精確調整培養條件,引導細胞的分化方向,可實現不同蛋白含量細胞培養肉的定制生產。但細胞分化受多種因素影響,不同種類來源的細胞分化條件不同,引導細胞分化的條件因素仍需探索,以便掌握精確控制細胞分化的方向和節點。

2.3 培養基的選擇

選擇合適的培養基是細胞培養肉面臨的另一挑戰。細胞培養肉對培養基有3個基本要求:首先,培養基能夠維持和促進細胞的正常生長；其次,培養基材料應安全可食用,符合食品安全要求;此外,培養基能夠規模生產、大量供應且成本低。體外培養的細胞通常采用的是合成培養基,合成培養基常需要添加一些生物提取液才能維持細胞的正常生長分裂。小牛血清因其來源豐富易保存而成為常用的合成培養基添加物,其成分主要包括生長因子、黏附因子、結合蛋白、維生素、礦物質、激素以及部分未知成分等真核細胞生長所必需的物質。然而,由于血清來源于動物體內,依然是病原體的潛在載體,且采集過程中存在雜質污染風險,不同批次質量差異較大等風險,影響細胞生長,采集血清還可能引起倫理等問題。因此,標準化的培養基和完全不含動物源性成分的無血清培養基研究和應用日益受到重視[8,24]。

無血清培養基是成分完全明確的血清替代品,相比血清培養基,無血清培養基具有質量穩定可控、可調,安全性高,有利于細胞分化純化等特點[25]。隨著研究的深入以及無血清培養基配方的調整,目前無血清培養基在細胞生長速率、細胞密度以及轉化率都不亞于血清培養基[26-27],并且通過改變無血清培養基組分可定向改變細胞增殖分化方向[28]。鑒于上述種種優勢,隨著技術的逐步成熟,無血清培養基可替代一部分血清培養基。但是無血清培養基并不是完美的,每類型的細胞需要一種培養基配方,培養基對細胞系有一定的選擇性,因血清中可能有保護、解毒殺菌的蛋白,在無血清的環境下對無菌要求更高。根據目前的實驗,雖然無血清可以培養細胞正常增殖生長,但存在細胞生長緩慢,傳代次數減少的現象。因此,無血清培養技術仍然存在適應性窄、易受理化因素影響、難保存等不足之處,需要進一步研究攻克這些難題,隨著生物學、生物材料科學以及微生物學的快速發展,無血清培養技術將逐步完善,推動細胞培養肉研究進展。

2.4 反應器與支架系統

反應器是根據細胞的生長特性,利用酶或生物體所具有的生物功能,模仿天然組織結構的生長環境,實現體外細胞規?；囵B的關鍵設備[28-29]。因動物細胞培養大多具有貼壁生長的特性,只有足夠大的表面積才能生產大量的細胞,因此,細胞培養肉的生產常需要中大型生物反應器進行大規模分化增殖培養。當然小型的反應器也具備中大型反應器所不具備的優勢：如多個小單元反應器具有更大的靈活性,能夠應對市場需求的波動；此外,當反應體系出現污染時,能及時阻斷污染擴散,更容易控制損失,小型反應器也是細胞培養器的首選[6]。進行體外細胞培養時除了考慮反應器的大小,還應考慮反應器的傳熱、傳質效率。良好的反應器不僅具有較高的傳質傳熱效率,還應在保持培養液低剪切力的前提下,保證大體積灌注的均勻性[30-31]。體外細胞培養不僅對反應器本身設計要求高,對反應器控制系統要求也極其嚴格。目前,反應器控制系統技術主要受限于微機電技術以及微流控技術的發展,模擬真實的體內生長環境仍有距離。大規模細胞培養仍未出現,這可能是反應器技術受限以及細胞培養肉規模擴大產生的效應問題。

支架系統作為反應器的重要組成部分,灌注在培養基中,為胚胎成肌細胞或骨骼肌衛星細胞增殖分化提供必要的附著體和載體[32]。為了優化肌肉細胞和組織形態結構,不同支架系統在形狀、組織和特征上各不相同。支架系統根據其材料可食用性分為可食用和不可食用支架。可食用的材料一般是采用一些天然材料,因為其可食用性培養后無需拆除。不可食用的材料可以是一些具有特殊功能特性的新生物材料,如促進細胞的增殖分化、蛋白合成、骨骼肌收縮等,但其培養后需要與培養肉進行分離[33]。理想的支架系統應有一個大的生長和附著表面積,為細胞提供足夠的生長空間。由于成肌細胞具有自發收縮的特性,因此,支架材料應有一定的收縮特性,能夠靈活地適應肌肉收縮運動,最大限度的使培養基擴散,并且不可食用材料應易于從培養肉中分離[30]。細胞培養技術要求支架可以模擬體內環境,成肌細胞增殖分化才能達到最佳狀態[31]。所以,支架系統的研究方向是開發出可食用(或者不可食用但易于剝離的)、具有柔性、可機械拉伸且可被細胞附著的材料。

目前,適用于構建網絡分支的支架系統的可食用材料較少。MACQUEEN等[34]在交聯明膠纖維支架上成功培養了牛主動脈平滑肌細胞和兔骨骼肌成肌細胞。交聯明膠纖維是動物源性的可食用材料,與其他常用材料如聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸等相比具有明顯優勢,但是目前的實驗室產品肌肉纖維含量偏低,成熟度有待提升,對體外細胞培養肉來說肌肉纖維和脂肪細胞合理搭配仍然存在巨大挑戰。不可食用的支架系統主要技術挑戰是支架與培養肉的分離,培養細胞片通常以機械或酶法進行分離,但這2種方法通常會損害細胞和細胞外基質。DA SILVA等[35]設計出一種熱響應涂層,該涂層在較低的溫度下會從疏水性變為親水性,并在冷卻后釋放完整的培養細胞和細胞外基質薄片,為堆疊法生產培養肉帶來了希望。然而,該技術目前仍然只能培養出簡單的細胞薄片,制造具有類似組織形狀的復雜幾何結構的細胞片仍然面臨巨大挑戰。

此外,支架系統還應該具有較好的傳質特性。為了加快營養介質的交換,可以加快營養介質流速和擴大支架材料孔徑,但隨著流速的提升,剪切應力也顯著增大,剪切應力的增大將影響細胞、組織以及機體的正常生理狀態,因此需要控制適宜的流速維持細胞的正常增長[36]。受限于細胞的大小,支架材料孔徑大小提升同樣受到限制。為了更好地提供傳質性,LEVEBBERG等[37]將成肌細胞,胚胎成纖細胞和內皮細胞在可降解支架上共培養,成功地在骨骼肌組織構造形成內皮血管網絡,使正在生長的組織血管化。但在培養過程中需要使用化學或生長因子等誘導劑,存在致畸致癌風險以及病毒引入等不利食品安全的因素,因此安全高性仍有待提升。目前支架系統技術仍在起步階段,大規模細胞培養的支架系統仍受很多技術限制,大規模商用仍然需要新生物材料的研發。

3 細胞培養肉面臨的商品化技術挑戰

目前大規模細胞培養肉商業化障礙不僅僅局限于技術方面,消費者的接受程度也一定程度上影響了其商業化進程?，F階段人們對培養肉接受程度偏低[38],主要原因是當前的細胞培養肉產品無法以安全經濟高效的方式模擬真實肉的品質。細胞培養肉不僅在營養上應不低于畜牧肉的營養成分,且在結構、香氣、味道及結構上與畜牧肉相似,符合大眾口味,確保產品具有安全性。

肉類的香味一直備受人們的喜愛和追捧,刺激人們的嗅覺和味覺。滿足味覺的同時,香味物質還能滿足營養物質的需求。通過對比肉類生熟之間化學組分發現,肉類的香味物質主要是在加工熟制過程中氨基酸與糖類發生美拉德反應生成的含氧、含硫和含氮雜環化合物以及部分小分子量的醛、酮、醇、脂[39]。肉類的特殊香味是肉中的蛋白質、脂質和香味物質相互作用的結果。細胞純培養由于無脂肪以及血液供應,培育產品口感差,由于缺乏脂肪的風味物質,導致產品香味不足,隨著細胞培養研究進展,肌細胞與脂肪細胞共培養有望解決口感香味不足的問題[40]。

此外,細胞培養肉的結構形狀是影響消費者接受程度的重要因素之一。目前,實驗室產生的細胞培養肉比較松散,無組織結構,無法產生肉的咀嚼感,消費者認為細胞培養肉更適合用于肉泥類產品加工,如香腸、丸類的加工[41]。近年來,食品3D打印技術的發展為培養肉建立合理的立體結構提供了新的解決方案。目前,最新的3D打印技術可以制造人造血管、局部控制打印材料的顆粒性和韌性,可以更好地模擬真肉的三維結構[42]。此外,還可以采用3D打印技術將培養肉進行重構,打印出在結構上更接近畜牧肉細微結構及形態的產品,可增加培養肉的可接受程度。

4 總結與展望

隨著經濟的快速發展,人口的不斷增長,全球對肉類需求日益增長,日益緊缺的資源和環境限制使飼養畜禽肉面臨巨大的挑戰。未來的肉類行業將會更加多元化復雜化,在肉類替代品中,細胞培養肉被認為是較有前途的選擇。目前國內外學者對細胞培養肉進行了大量的研究,然而其規?；蜕唐坊悦媾R很多技術挑戰,細胞培養過程中種子細胞選擇、細胞增殖與分化、培養基種類、反應器和支架系統等關鍵技術仍存在一些技術難點需要攻克。細胞培養肉的色、香、味及結構是其商品化道路仍需要改善的主要因素。隨著組織工程學、生物醫學等學科的發展,新細胞系的研究將為細胞培養技術提供更多的技術支持。新的生物技術,如基因工程技術、生物光子技術、納米技術、3D打印技術、離心澆鑄技術、磁力驅動生物技術以及靜電紡絲等技術的發展,為細胞培養肉產業化提供新的動力。作為一種無屠宰和可持續發展的技術,細胞培養肉最終可能與傳統肉類進行競爭,以緩解人們對肉類需求的壓力。