UPLC 法同時測定紫菀中三種綠原酸類物質的含量

王 蓉，李斐然，郭偉娜*，史學禮

（1.安徽省中醫藥科學院 亳州中醫藥研究所，安徽 亳州 236800；2. 安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230031；3. 亳州市食品藥品檢驗中心，安徽 亳州 236800）

中藥紫菀為菊科植物Aster tataricus L.F.的干燥根和根莖[1]。多生長于潮濕的陰坡、草地、河邊、沼澤等地方，海拔400 ～2 000 m，別名：青菀、紫倩、小辮、返魂草[2]。據統計全世界約有250 種，廣泛分布于亞洲，北美洲，歐洲，其中中國約有近百種，主要產地有安徽，河北，河南，甘肅，東北，內蒙古，山西，陜西及甘肅南部等地[3]。紫菀在我國有著悠久的應用歷史，是中醫治療咳喘的常用中藥[4]，臨床常切厚片生用或蜜炙后應用[5]。紫菀用途廣泛，國內已有三百多年的栽培史，藥材資源非常豐富。現代研究表明紫菀中化學成分較多，主要含有三萜及其苷類、甾醇類、蒽醌類、肽類及黃酮類[3-6]。三萜類成分主要有紫菀酮[7]、表木栓醇、木犀草素等，皆有止咳、化痰、平喘的功效。黃酮類成分是抗炎鎮痛的主要活性成分之一[8]，山奈酚和槲皮素具有明顯的抗氧化作用[9]，并且在抑制溶血和免疫調節方面也有較好的作用[10]。綠原酸具有抗過敏、抗氧化、預防心血管疾病、抗腫瘤、抗菌、促進糖類和脂質代謝等作用。香豆素類物質具有抗HIV、抗炎等多種藥理活性[11-12]。此外紫菀尚具抗病毒、利尿等藥理作用。

目前紫菀常用的含量測定方法是高效液相色譜法，鮮有超高效液相色譜的報道。超高效液相色譜具有迅速高效的優點，采用超高效液相色譜（UPLC）法建立測定紫菀中綠原酸類物質含量的方法，為紫菀藥材的質量控制提供更高效的途徑。并采用此方法對紫菀的根、根莖、芽三個不同部位的綠原酸，異綠原酸A，異綠原酸B 的含量進行比較，為紫菀的合理應用提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子分析天平（梅特勒托利多，型號XPE26）；Waters Acquity 超高效液相色譜儀，Acquity UPLC BEH C18 色 譜 柱 ；700VED 型 數 控 超 聲 清 洗 器（100 W，25 kHz，合肥金尼克機械制造有限公司）；1 mL、5 mL、10 mL 移液管，100 mL 溶量瓶，量筒，德國Brand 公司，均檢定為 A 級[13]。

1.2 試藥

綠原酸（批號：wkq19010201，四川省維克奇生物科技有限公司）、異綠原酸A（批號：18121001，成都普菲德生物技術有限公司）、異綠原酸B（批號：17121201，成都普菲德生物技術有限公司）。甲醇、乙腈、0.1%磷酸為色譜醇，純化水等。

實驗藥材來自亳州不同地區，有亳州市十九里馬寨村、譙東區銅關村，經安徽中醫藥大學方成武教授鑒定為紫菀（Aster tataricus L.f），采挖時間為2019 年3 月17 日。

2 方法

2.1 方法

2.1.1 對照品溶液的配制

分別稱取綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 對照品適量，精密稱定，分別加甲醇溶解制成每1 mL含綠原酸0.046 30 mg 、異綠原酸A 0.045 41 mg、異綠原酸B 0.014 30 mg 的對照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的配制

將新鮮的紫菀藥材洗凈后進行分類，可得到紫菀根莖、紫菀根、紫菀芽（母根）3 個藥用部分，用烘箱進行烘干，粉碎后再過四號篩，可得3 個紫菀根莖、紫菀根、紫菀芽（母根）的樣品粉末，取各樣品粉末約1 g，精密稱定，至具塞的錐形瓶中，精密量取甲醇50 mL，稱重，超聲處理30 min，放冷后稱重，用甲醇補足后搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，得100%甲醇提取供試品溶液。再取各樣品粉末約1 g，加80%甲醇50 mL，按上述相同的方法進行操作，即得80%甲醇提取供試品溶液。

2.1.3 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 mm 50 mm，1.7 μm）；流動相A 為乙腈，B 相為0.1%磷酸，梯度洗脫；檢測波長：330 nm；流量：0.20 M/min；柱溫：30 ℃ ；進樣量：1 μL。色譜圖見圖1。

圖 1 供試品（A）、混合對照品（B）UPLC圖

2.2 結果

2.2.1 線性關系的考察

精密量取3 種對照品溶液1、5、10、20、100 mL于100 mL 量瓶中，分別用甲醇稀釋至刻度，制得各對照品系列質量濃度，按照2.3 項下色譜條件測定。以綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 進樣量為縱坐標（y），對應峰面積為橫坐標（x），分別繪制曲線，得到回歸線方程分別為：綠原酸y=0.0002x+4E-15（r=1）、異綠原酸Ay=8E-0.5x+0.0948（r=0.9997）、異綠原酸By=7E-0.5x（r=1）。結果表明綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 進樣量分別在0.463～46.3 mg、0.4541 ～45.41 mg、0.1430 ～14.30 mg 范圍內線性關系良好。

2.2.2 精密度試驗

精密吸取2.1 項下3 種對照品溶液，按2.3 項下色譜條件采用標準對照法進行測定，重復測定6 次，進樣量1 μL。結果綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 的RSD 值分別為1.09%（n=6）、0.82%（n=6）、1.53%（n=6），結果表明精密度良好。

2.2.3 穩定性試驗

取上述供試品溶液，分別于0，3，6，12，24 h測定綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 的峰面積，進樣量1 μL，結果相應3 種成分峰面積的RSD 值分別為1.46%（n=6）、1.28%（n=6）、2.01%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內穩定性較好。

2.2.4 重復性試驗

取同一批紫菀樣品6 份，精密稱定，分別按2.2項下的方法制備供試品溶液，按2.3 項下色譜條件采用外標一點法測定，進樣量1 μL，結果樣品中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 的平均質量分數分別為0.036 0，0.006 5，0.001 1 ，相對標準偏差分別為1.62%，1.05%，1.00%

2.2.5 加樣回收試驗

取已知含量的紫菀樣品，共6 份，各約1 g，精密稱定，分別精密加入綠原酸對照品溶液（4.63 μg/mL）、異綠原酸A 對照品溶液（4.541 μg/mL）、異綠原酸B 對照品溶液（1.430 μg/mL），加入甲醇補足至100 mL，按2.2 項的方法操作，制得供試品溶液，按2.3 項下色譜條件采用標準對照法進行測定，進樣量1 μL ，試驗測得綠原酸回收率為98.7%（RSD=1.68%）， 異 綠 原 酸A 的 回 收 率 為96.6%（RSD=1.04%），異綠原酸B 的回收率為97.14%（RSD=0.98%）。

2.2.1 紫苑地下不同部位不同濃度甲醇提取液各種綠源酸含量

表1 紫菀地下不同部位、不同濃度甲醇提取液各種綠厚酸含量比較

根據實驗結果發現，紫菀根、紫菀根莖、紫菀芽（母根）中，根莖中綠原酸類的含量最高。紫菀根中所含綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 的量在三者中最低。采用甲醇、80%甲醇溶液分別提取紫菀地下不同部位，運用比較法可以得出，把甲醇作為提取溶劑更具有優勢。因為提取效率更高，樣品干擾少，使得測定結果更加準確和明了。

2.2.7 檢測波長的確定

通過對綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 三種成分紫外吸收曲線的分析比較，可以得出紫菀藥材不同部位中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 均在330nm 左右有較高的紫外可見吸收，使得檢測更加方便、檢測結果更加準確，各成分色譜峰分離的更加分散，沒有集中在一塊，實驗結果更加明顯和突出。

2.2.8 流動相的確定

對多種流動相進行了嘗試，其中包括甲醇-磷酸溶液、甲醇-甲酸溶液、乙腈-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液等流動相系統。實驗發現以乙腈-磷酸溶液流動相，可以使綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 各成分的峰形和分離度良好，最終選擇乙腈-磷酸溶液為流動相。

2.2.9 提取溶劑與提取方法的確定

此次試驗分別采用80%甲醇、100%甲醇溶液配制供試品溶液。并對超聲提取與加熱回流兩種提取方法進行了考察，經過測定之后得出，用100%甲醇配制的供試品溶液中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 的含量比用80%甲醇配制的供試品溶液的含量高。實驗還發現不同提取方法對所測含量的影響不大，但超聲提取相對簡單、方便、快捷、節約時間，因此選用100%甲醇為溶劑超聲提取紫菀藥材。

2.2.10 濃度的確定

參照圖2 的光譜圖，各成分的吸光度大致都在0.2 ～0.7 范圍之內。所以使用此濃度更加合適，各成分的色譜峰分離度滿足色譜系統試驗要求。在此濃度下進行實驗，使測定的數據更加合理和準確，最終的結論更加具有說服力和可信度。

3 結論

首先建立了超高效液相色譜法（UPLC）同時測定綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B 含量的方法，方法簡單方便、快速高效、分離度較好、靈敏度高，而且應用范圍廣泛，適應性較好，從供試品色譜圖中可以看出精密度、穩定性、線性關系、重復性、加樣回收率的測定都符合實驗要求，各成分的峰形均比較良好，峰面積與濃度成正比例。其次實驗測定了紫菀不同地下部位三種綠原酸類物質的含量，發現紫菀地下不同部位綠原酸類物質的含量存在差異，其中紫菀根莖中綠原酸類的含量最高。芽（母根）中綠原酸類物質的總含量介于根與根莖之間，但根據藥典芽屬于非入藥部位。目前未見使用超高效液相色譜法測定紫菀中各成分的含量，超高效液相色譜法為紫菀的質量控制提供了有效的可靠地分析方法，對進一步研究紫菀的各種成分的含量差異，充分發掘其新的藥用價值具有一定的意義，期望通過更深入的研究促進紫菀各部位合理使用。