分子標記輔助選育聚合煙草花葉病毒屬病毒抗性基因（L4）及馬鈴薯Y病毒抗性基因（Pvr4）的甜椒自交系

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

我國是世界上辣椒栽培面積最大、產量最高的國家（http：//www.FAO.org）。辣椒已成為我國最大的蔬菜產業（王立浩 等，2019）。長期以來，病毒病一直是制約辣（甜）椒生產的主要因素之一。據報道，至少有20 余種主要的病毒可侵染辣椒和甜椒（Moury & Verdin，2012），其中煙草花葉病毒屬病毒（Tobamovirus）和馬鈴薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）是侵染辣椒最為普遍的病害，在我國多地辣椒產區均有檢出（郭思瑤 等，2015；劉勇 等，2019），嚴重影響辣椒產量和品質。

辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）是煙草花葉病毒屬的典型成員，煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）和番茄花葉病毒（tomato mosaic virus，ToMV）也是該病毒屬病毒，在辣椒生產上發生十分普遍（王亞南，2008；秦蕾和梁燕，2016）。根據煙草花葉病毒屬病毒和其抗性基因L的致病關系，可將其分為5 種致病型：P0、P1、P1，2、P1，2，3、P1，2，3，4（García-Luque et al.，1990；Velasco et al.，2002；Antignus et al.，2008）。辣椒輕斑駁病毒（PMMoV）最早在美國發現，我國于1994 年首次在新疆產區發現（向本春等，1994），之后在多地均有檢測發現（黃粵 等，2005；李興紅 等，2005；夏惠娟 等，2006；Wang et al.，2006），檢出比例較高。劉勇等（2019）于2013—2017 年對我國31 個省（市、自治區）開展辣椒主要病毒病發生情況調查，結果表明PMMoV檢出比例僅次于TMV 和黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）。PMMoV 通過帶毒種子、感病植株和感病土壤均可傳播，病毒在干燥的植物病殘體上可存活25 a，防治極為困難。抗病育種是防治該病毒病最有效方式之一。L系列等位基因（L1、L2、L3、L4）是煙草花葉病毒屬的主要抗性基因（Boukema，1980，1982；Genda et al.，2007；Tomita et al.，2011），已在辣椒抗煙草花葉病毒屬病毒育種上得到廣泛應用。L4基因最早在辣椒種C.chacoense資源PI 260429 中被鑒定發現，該基因對煙草花葉病毒屬病毒（TMV、ToMV、PMMoV）具有廣泛抗性，除P1，2，3，4致病型外，對其余4種致病型均具有抗性（Genda et al.，2007）。國內外研究學者先后開發或轉化獲得與L4基因連鎖的RAPD、AFLP、SCAR、SNP 各類型標記（Matsunaga et al.，2003；Kim et al.，2008；Yang et al.，2009，2012）。L基因特異分子標記的開發可以快速篩選鑒定含有L基因的抗性資源，提高抗病基因轉育的效率。

馬鈴薯Y 病毒屬于馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus），寄主廣泛，可侵染馬鈴薯、煙草、番茄和辣椒等茄科作物，在世界范圍內廣泛發生。主要依靠蚜蟲（以綠色桃蚜為主）以非持久方式進行傳播（Green & Kim，1991；李寧 等，2018）。目前在辣椒上已鑒定出多個PVY 的抗性基因（Cook，1960；Dogimont et al.，1996；Caranta et al.，1999），其中Pvr4基因為顯性，來源于辣椒材料CM334（Criollo de Morelos-334’，Dogimont et al.，1996），該材料對PVY 的所有3 個小種PVY（0）、PVY（1）、PVY（1，2）和PepMoV 均表現為抗病，還未有該基因抗性被克服的報道。目前已開發和報道了與PVY 抗性基因Pvr4連鎖的RAPD、AFLP、SCAR、SNP 各 類 型 標 記（Caranta et al.，1999；Arnedoandrés et al.，2002；Devran et al.，2015），可應用于辣椒抗病材料輔助選擇和抗病基因轉育中。

本試驗以創制聚合煙草花葉病毒屬病毒抗性基因（L4）和馬鈴薯Y 病毒抗性基因（Pvr4）的甜椒自交系為主要目標，利用引進的抗源材料，采用常規回交轉育、分子標記輔助選擇（marker assisted selection，MAS）結合田間抗病性鑒定的方法，將抗性基因Pvr4和L4轉育聚合到甜椒優異自交系83-163 中，為今后多抗辣（甜）椒品種的培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜椒83-163 為中國農業科學院蔬菜花卉研究所辣椒課題組選育的大果型甜椒自交系，果實方燈籠形（縱徑8.2 cm，橫徑7.1 cm），綜合性狀優良，早熟性好，中抗疫病和CMV，配合力強，是中椒系列品種的親本之一，但其對PMMoV 和PVY 表現高感（圖1）。CM334（引種號200380）和200375（引種號200375）均是本課題組2003 年從法國引進的種質資源，CM334 果實短錐形（縱徑6.3 cm，橫徑2.5 cm），植株分枝性強，莖部絨毛明顯，田間病毒病抗性好，人工接種PVY 致病型PVY（1，2）后，有過敏反應出現，PVY 抗性表現高抗，含有Pvr4抗性位點。200375（C.annuumL.）為一年生辣椒，L4抗性位點來自C.chacoense（PI 260429），為轉育后經過高代分離的純合材料，果實方燈籠形（縱徑7.1 cm，橫徑6.5 cm），人工接種鑒定PMMoV（P1，2，3）抗性表現高抗。

1.2 馬鈴薯Y 病毒和辣椒輕斑駁病毒人工接種鑒定

PVY 和PMMoV 人工接種鑒定在法國農業科學院Benoit Moury 博士實驗室進行，PVY 和PMMoV 接種鑒定方法分別參考Caranta 和Palloix（1996）及Kim 等（2008）的方法。PVY 鑒定株系為PVYson41（P1，2），PMMoV 鑒定株系為PMMoV（P1，2，3），每個材料接種30 株，接種15～20 d 后進行調查。

1.3 選育過程

自2005 年，分別以材料CM334（抗PVY，含Pvr4基因）和200375（抗PMMoV，含L4基因）為抗源，以甜椒自交系83-163（中抗疫病和CMV）為回交親本，進行兩兩雜交。PVY 抗性鑒定利用Pvr4特異CAPS 標記（Pvr4-CAPS，Caranta et al.，1999）對回交后代分別進行單株選擇；PMMoV 抗性鑒定利用人工接種的過敏性反應進行單株選擇，對回交后代的園藝性狀進行調查，保留園藝性狀近于回交親本83-163 的多個BC4抗病單株。然后將含有L4位點（83-163L4）和Pvr4位點（83-163Pvr4）BC4材料進行雜交，自交2 代，輔助分子標記選擇（L4-SCAR，Kim et al.，2008；Pvr4-CAPS，Caranta et al.，1999），獲得聚合L4和Pvr4位點的多個BC4F2單株（PT83-163BC4F2）。對每單株后代自交留種，利用標記篩選，最終確定抗性位點Pvr4和L4均純合的株系（Pvr4Pvr4&L4L4），自交2 代后獲得PT83-163BC4F4后代，對其進行性狀觀察和人工接種抗病性鑒定，詳細轉育過程如圖2所示。

1.4 DNA 提取及分子標記輔助選擇

植物基因組DNA 提取采用改良CTAB 方法（Saghai-Maroof et al.，1984）。利用L4基因特異標記L4-SCAR 對后代進行篩選，PCR 反應體系參考Kim 等（2008）的方法，擴增后PCR 產物利用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，電壓為140 V，30 min。利用Pvr4基因特異標記Pvr4-CAPS 對后代Pvr4陽性株進行篩選，PCR 反應體系參考Caranta 等（1999）的方法，擴增后PCR 產物利用AlwNⅠ酶切過夜后，利用8%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測（抗病，444 bp；感病，458 bp），恒壓160 V，2.5～3.0 h，快速銀染法染色。

2 結果與分析

2.1 苗期人工接種鑒定200375 與83-163 后代的PMMoV 抗性

利用人工接種鑒定的方法篩選200375×83-163 后代中PMMoV 抗病單株（圖3），接種后2 周內觀察植株是否有過敏性反應出現。出現過敏性反應，表現抗病的單株保留，并繼續回交。最終獲得抗病單株BC4（83-163L4）。

2.2 分子標記輔助轉育Pvr4 抗性基因

利用Pvr4特異分子標記Pvr4-CAPS 分別對83-163×CM334 的雜交及回交后代進行篩選，保留陽性單株并進行回交。圖4 為BC4（83-163 ×CM334）群體部分單株篩選結果，63 株BC4后代中，26 株經AlwNⅠ酶切后獲得了抗病特異條帶（444 bp，單株泳道1、5、9、10、11、13、14、15、16、17、24、26、32、34、35、40、42、43、45、50、51、57、58、60、61、62），且帶型均為雜合，陽性單株比例接近1∶1。

2.3 分子標記輔助選育聚合抗病基因L4 和Pvr4甜椒自交系PT83-163

利用抗病基因L4連鎖標記L4-SCAR 和Pvr4連鎖標記Pvr4-CAPS 篩選83-163Pvr4×83-163L4的雜 交BC4F1和BC4F2群體，保留L4和Pvr4基 因檢測均為陽性的單株并進行自交。圖5 為PT83-163BC4F1部分單株L4-SCAR 標記篩選結果，含有L4基因的單株可擴增出抗病特異條帶（340 bp）。結果顯示，46 株單株中，25 株經檢測含有L4基因，抗性分離比例接近1∶1。

獲得PT83-163BC4F2群體中聚合L4和Pvr4位點的多個陽性單株后，對每個單株分別自交留種。每個單株挑取30 株自交后代，利用標記L4-SCAR 和Pvr4-CAPS 進行篩選，保留后代中2 個抗性位點Pvr4和L4均純合的株系（Pvr4Pvr4&L4L4），對該株系自交2 代，最終獲得PT83-163BC4F4（Pvr4Pvr4&L4L4）后代。

2.4 甜椒自交系PT83-163 的PMMoV 和PVY 抗性人工接種鑒定

2013 年委托法國農業科學院對含有L4和Pvr4抗性位點的PT83-163BC4F4株系的后代進行PMMoV 和PVY 的人工接種抗病性鑒定。結果表明（表1），PT83-163BC4F4的后代對PVY（P1，2）和PMMoV（P1，2，3）均表現為抗病，83-163 和感病對照Yolo wonder 均表現感病。

表1 PT83-163BC4F5 人工接種抗病性鑒定結果

2.5 PT83-163 園藝性狀表現

田間農藝性狀調查發現，聚合L4和Pvr4位點的PT83-163BC4F4株系與原輪回親本甜椒自交系83-163 的植株、葉、花、果等農藝性狀均接近（圖6），果實方燈籠形，4 心室，早熟，定植后25 d 商品成熟，果肉薄，青熟果綠色，老熟果紅色，果面微皺，單果質量150 g。

3 結論與討論

隨著越來越多的基因被定位和克隆，分子標記開發技術的完善和標記類型的增多，分子標記輔助選擇（marker assisted selection，MAS）在育種中的應用愈發廣泛，特別是對于一些不能直接通過表型觀察和田間鑒定的性狀如產量、抗病性、抗逆性，以及多個性狀的聚合，MAS 優勢明顯。如傳統抗病育種很難實現多個抗性基因的聚合，費時費力，且存在鑒定結果重復性差、周期長等問題，MAS的應用可以大大提高育種效率，提高鑒定結果的準確性。目前在辣椒上已獲得了大量與抗病基因緊密連鎖的分子標記（Tai et al.，1999；Sugita et al.，2004；Kim et al.，2008；Kang et al.，2010；王立浩 等，2012；Liu et al.，2014；Sun et al.，2015），本試驗利用L4位點連鎖標記L4-SCAR 和Pvr4位點連鎖標記Pvr4-CAPS 對后代進行選擇，擴增條帶穩定，分子標記選擇結果與田間人工接種鑒定結果一致，結果準確，大大提高了育種的效率和準確性。因此，在今后工作中應更加注重分子標記與育種的結合。

病毒病一直是威脅辣椒生產的重要病害，常導致辣椒葉片壞死、枯斑、褪綠，植株矮化，落花、落果，對辣椒生產造成嚴重損失（秦蕾 等，2017；于海龍 等，2019）。其中煙草花葉病毒屬病毒（Tobamovirus）一直是威脅辣椒生產的主要病毒，據報道該屬中有13 種病毒能夠侵染茄科作物并引起嚴重危害（Li et al.，2018）。PMMoV 近些年在我國多地辣椒產區被檢測發現，主要分為P1，2、P1，2，3、P1，2，3，4等3 種致病型（García-Luque et al.，1990；Velasco et al.，2002；Antignus et al.，2008）。目 前我國辣椒生產上PMMoV 致病型多以P1，2株系為主（張強 等，2014；李廷芳，2016），L3基因對煙草花葉病毒屬病毒PMMoV（P1，2），P0（ToMV）和P1（paprika mild mottle virus，PaMMV）株系類型均具有抗性。本課題組在前期研究中已育成多個含有L3基因辣（甜）椒品種，在生產中的PMMoV抗性表現良好。L4基因對除P1，2，3，4致病型外的其余4 種致病型均具有廣泛抗性，轉育L4基因對于國內辣椒抗病育種具有重要的前瞻意義。本試驗利用分子標記輔助選擇結合回交育種，實現了聚合煙草花葉病毒屬病毒抗性位點L4和PVY 抗性位點Pvr4的骨干自交系83-163 的種質創新，經人工接種鑒定PT83-163 對PMMoV 和PVY 均表現抗病，可用于下一步雜交組合的配制，為實現辣椒品種多個抗性基因的聚合提供了借鑒思路。