“十三五”我國甘藍遺傳育種研究進展

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，農業農村部園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京 100081）

結球甘藍（Brassica oleraceaL.var.capitataL.）簡稱甘藍，是一種重要的十字花科蔬菜作物。甘藍具有較強的適應性和抗逆性，其葉球中含有豐富的營養物質，在世界各地普遍栽培。據統計，我國甘藍的種植面積約90 萬hm2（楊麗梅 等，2020），居世界第一位，在全國蔬菜周年供應及出口貿易中占有十分重要的地位。“十三五”以來，在國家重點研發計劃、大宗蔬菜產業技術體系、國家自然科學基金及一些省部級科研項目的支持下，我國甘藍遺傳育種取得了重要進展：獲得省部級獎勵3 項，授權發明專利30 余項，發表文章90 余篇；通過遠緣雜交、小孢子培養及基因編輯等技術創制出優良育種材料逾100 份，對重要農藝性狀基因進行了定位或克隆，并開發了可用于輔助選擇的分子標記，培育出一批優質、多抗、適應性強的甘藍新品種，顯著提升了我國甘藍遺傳育種的水平。

1 種質資源的搜集、鑒定與創新

1.1 種質資源的搜集與鑒定

優良種質資源是甘藍新品種培育的基礎。據中國農業科學院蔬菜花卉研究所、北京市農林科學院蔬菜研究中心、江蘇省農業科學院蔬菜研究所等國內7 家科研單位統計，近5 年來國內主要甘藍育種單位共搜集、引進國內外甘藍種質資源逾500份，為優良新品種培育奠定了材料基礎。王神云等（2016）對搜集的88 份甘藍種質材料進行苗期和成株期根腫病抗性鑒定，獲得抗ECD17/31/13 生理小種的材料5 份。馬丹丹等（2016）通過人工注射法結合分子標記輔助選擇對94 個甘藍類蔬菜品種進行根腫病抗性鑒定，從中篩選出高抗4 號生理小種的甘藍品種11 個。孫超等（2016）對22 份甘藍材料的根腫病抗性進行鑒定，篩選出3 份對河南新野菌種免疫的材料和1 份對陜西太白菌種表現高抗的材料。Ning 等（2018）對102 份甘藍種質資源進行根腫病抗性鑒定，篩選出高抗4 號生理小種的材料4 份。張小麗等（2019）對306 份甘藍類蔬菜品種（系）進行根腫病抗性鑒定發現，甘藍類蔬菜中抗根腫病資源嚴重匱乏，僅從青花菜中篩選出1份高抗材料。孔樅樅等（2018）通過人工接種鑒定從99 份國內外甘藍種質資源中篩選獲得54 份高抗枯萎病材料和26 份抗黑腐病材料，其中包括5 份對枯萎病和黑腐病表現雙抗的材料。李岸（2019）對64 份甘藍種質資源進行苗期枯萎病抗性鑒定，篩選出抗病材料41 份，其中高抗材料12 份。

對上述抗性材料的地理來源進行分析發現，日本、韓國等國家的抗病資源較我國豐富。廣泛搜集和引進優良種質資源仍將是未來一段時間內我國甘藍遺傳育種尤其是抗病育種的重要任務。

1.2 優異種質創新

1.2.1 通過小孢子培養創制優良DH 系 甘藍常規育種中，通常需要6～7 代的連續自交才能育成純合穩定的親本自交系，育種周期較長，而通過游離小孢子培養技術可在2 a 內獲得純合的雙單倍體DH 系，大大縮短育種周期，提高育種效率。蘇賀楠等（2018）通過對小孢子培養條件、培養基成分和培養方式進行改進和優化，顯著提高了甘藍小孢子成胚率，并成功誘導20 個基因型產生了胚狀體，其中雜交種中甘628 和自交系01-88 出胚率最高，分別達到19.8、47.5 胚·蕾-1。通過田間表型鑒定，初步篩選出一批農藝性狀優良的DH 系如2189 DH13、SH11DH5、SH10DH22、根372DH13、根373DH7、2006DH1 等，已開始用于試配雜交組合（蘇賀楠，2020）。

1.2.2 通過遠緣雜交創制優異育種材料 為實現甘藍類蔬菜Ogura 胞質不育資源的利用，于海龍（2018）利用遠緣雜交結合胚挽救技術，將甘藍型油菜中的Ogura 胞質不育恢復基因Rfo成功導入芥藍中，并通過多代回交結合標記篩選，成功獲得育性恢復穩定、染色體數目正常（2n=18）的芥藍Ogura CMS 恢復系。以該恢復系作為橋梁，對抗根腫病甘藍Ogura 胞質不育材料進行了育性恢復，獲得了含有根腫病抗性位點CRb的育種材料，為抗根腫病品種培育提供了一條新途徑（Yu et al.，2016；Ren et al.，2020）。此外，寧宇（2019）利用抗根腫病大白菜與甘藍進行遠緣雜交和回交，獲得4 株含有根腫病抗性位點CRa和CRb的BC1抗病材料。彭麗莎等（2016）利用抗根腫病大白菜品種CR-春美、CR-英雄與甘藍進行遠緣雜交，結合胚挽救技術獲得對根腫病4 號生理小種和11 號生理小種表現抗病的種間新種質，豐富了甘藍抗根腫病的育種材料。

1.2.3 通過基因編輯技術創制優良育種材料 以CRISPR/Cas9 為代表的基因編輯技術是植物基因功能研究及作物改良的有力工具，目前該技術已在多種作物精準育種方面發揮了重要作用。Ma 等（2019）在結球甘藍中建立了高效的基因編輯技術體系，結合tRNA 多靶點表達載體，完成甘藍八氫番茄紅素脫氫酶基因BoPDS、雄性不育相關基因MS1、自交不親和基因BoSRK的定點突變，不同基因突變效率在30%以上，自交結果顯示，突變位點可以遺傳到子一代。Cao 等（2021）利用CRISPR/Cas9 技術對甘藍蠟質合成相關基因BoCER1進行敲除，成功獲得蠟質缺失亮綠甘藍材料。CRISPR/Cas9 基因編輯技術在甘藍中的成功應用，為后續甘藍多基因聚合育種奠定了堅實的技術基礎。通過基因編輯獲得的甘藍自交親和系、雄性不育系、蠟質缺失突變體等對后續甘藍遺傳育種研究具有重要的應用價值。

2 甘藍重要基因/QTL 研究

“十三五”以來，為了提高育種效率，加快育種進程，各單位先后開展了與甘藍抗病、抗逆、雄性不育及無蠟粉亮綠等性狀相關的基因/QTL 的定位與克隆研究，并開發了緊密連鎖的分子標記，為甘藍分子聚合育種奠定了基礎。

2.1 甘藍抗病基因/QTL 研究

2.1.1 枯萎病抗性基因的克隆與功能分析 甘藍枯萎病是一種由尖孢鐮刀菌粘團專化型致病菌引起的土傳病害，一旦發生將在土壤中存活10 a 以上且無法根除。Liu 等（2019）收集并鑒定了國內20 份枯萎病致病菌分離物，并與國際標準菌株進行比較，發現國內枯萎病致病菌幾乎全部為1 號生理小種，且致病力均高于國際標準菌株。目前已知甘藍對枯萎病1 號小種的抗性受顯性單基因控制（劉星，2017；Liu et al.，2017a）。

在枯萎病抗性基因克隆方面，劉星（2017）構建了甘藍抗枯萎病基因FOC1的過表達載體，并通過農桿菌介導的遺傳轉化將其導入感病甘藍自交系材料XW 中，獲得了FOC1基因高表達的陽性植株，抗性鑒定結果表明，轉基因陽性植株的抗病能力顯著提升，人工接種后未出現發病癥狀。此外，基于全基因組重測序數據，Liu 等（2017a）開發了與甘藍枯萎病抗性緊密連鎖的分子標記Frg13，物理距離為75 kb，利用標記輔助育種準確率達95%以上，提高了抗病材料的篩選效率；與此同時，以抗病DH 系材料D134 作為抗性供體親本，結合標記篩選通過回交的方式將抗枯萎病基因成功轉移到優質的骨干親本01-20 中，為甘藍抗枯萎病優質品種的培育奠定了基礎。

2.1.2 黑腐病抗性QTL 定位 甘藍黑腐病是由野油菜黃單胞菌野油菜致病變種侵染引起的細菌性病害，近年來，隨著甘藍栽培面積的增加，其危害程度也日益嚴重。目前多數研究表明，甘藍對黑腐病的抗性受多個基因控制。孔樅樅（2019）通過遺傳分析發現，甘藍對黑腐病1 號生理小種的抗性由1對加性主基因+加性-顯性多基因控制；利用抗感雙親構建的F2群體結合QTL-seq 技術，將抗1 號生理小種的QTL 定位在3 號染色體25.44～31.72 Mb 區間內，兩側標記分別為I254 和I317，該區域最高可解釋38.4%的表型變異。此外，劉澤慈（2019）利用重組自交系與染色體片段替換系將甘藍抗黑腐病3 號生理小種的主效QTL 位點qBR-7-3定位在7 號染色體2.91 Mb 的區間內，該區域可解釋16.72%的表型變異，推斷該區間內NBSLRR 類型基因Bo7g111290可能為抗病基因。上述開發的標記以及確定的抗性位點為分子標記輔助抗病育種及黑腐病抗性基因的克隆奠定了基礎。

2.1.3 根腫病抗性QTL 定位 根腫病是一種由蕓薹根腫菌侵染引起的危害極大的土傳病害，俗稱“根癌”，目前已成為全球十字花科蔬菜產區的主流病害之一。隨著十字花科蔬菜栽培面積的擴大、商品種子和蔬菜產品的相互調運及長期連作，我國根腫病的發生面積也在逐年擴大。

研究表明，甘藍對根腫病的抗性是由多基因控制的數量遺傳性狀。張小麗（2017）將野生甘藍B2013 中抗根腫病4 號生理小種的主效位點定位在C09 染色體32.01～40.01 Mb 的區間內，并推測區間內的Bol044005為可能的抗性候選基因。Peng 等（2018）利用SNP 基因芯片在甘藍抗病材料中檢測到23 個與根腫病抗性連鎖的QTL 位點，可解釋的表型變異介于6.1%～17.8%之間。寧宇（2019）結合QTL-seq 技術，將甘藍抗病材料2358 中抗4號生理小種的1 個QTL 位點qBoCR8.1定位在8 號染色體500 kb 的區間內，該區間可解釋16.4%的表型變異。這些抗根腫病QTL 位點的確定為抗源材料的篩選和抗病基因克隆奠定了基礎。

2.2 甘藍抗逆相關QTL 研究

2.2.1 耐抽薹QTL 定位 甘藍屬于綠體春化植物，如果在結球前遇到長時間的低溫和長日照條件滿足其春化要求，就會發生先期抽薹，嚴重影響其產量和品質。研究表明，甘藍未熟抽薹的難易程度是受多個基因控制的數量遺傳性狀，同時受環境因素的影響（王五宏等，2020）。陳登輝等（2018）利用耐抽薹和易抽薹材料構建的重組自交系群體對甘藍耐抽薹QTL 進行定位，在8 號染色體上檢測到1 個QTL 位點qbt-2-2，貢獻率為9.1%，獲得連鎖分子標記CB10139。此外，王五宏等（2020）采用SLAF-BSA 方法在甘藍2 號染色體2.31～3.09 Mb 和33.57～34.40 Mb 區間內定位到2 個耐抽薹QTL 位點。以上耐抽薹位點及其連鎖標記的獲得可用于耐抽薹材料的輔助選擇，提高育種效率。

2.2.2 耐裂球QTL 定位 在甘藍栽培過程中，時常會出現葉球開裂的現象，嚴重影響外觀和品質。研究表明，甘藍耐裂球性狀的遺傳符合G-0 模型，即該性狀的遺傳受3對加性-上位性主基因+加性-上位性多基因控制（蘇彥賓等，2019）。朱曉煒等（2018）結合QTL-seq 技術將甘藍耐裂球QTL 定位在3 號染色體上46～51 Mb 的區間內，并將與擬南芥細胞壁合成相關基因At4g38770和At4g19120的同源基因Bol016058和Bol029881確定為候選基因。該研究可為甘藍耐裂球分子設計育種提供參考。

2.3 甘藍蠟質缺失基因的定位與克隆

普通甘藍植株表面覆蓋有一層蠟質，球葉顏色表現為綠色、灰綠色或深綠色，而甘藍蠟質缺失突變體的球葉則呈現為亮綠色，具有良好的商品性。Liu 等（2017b）以甘藍隱性蠟質缺失突變體LD10 及其野生型為材料，通過圖位克隆將與擬南芥CER4同源的基因Bol013612確定為候選基因，突變體中該基因發生單堿基突變導致其mRNA 轉錄剪切異常，通過轉基因試驗最終證明LD10 的蠟質缺失性狀是由Bol013612突變造成。Ji 等（2018）以甘藍隱性蠟質缺失突變體g21-3 及野生型為材料，通過圖位克隆技術獲得g21-3 蠟質缺失候選基因BoCER1，突變體中該基因第4 個內含子中插入了1 個252 bp 的片段，該片段的插入嚴重抑制了該基因的表達，根據插入位點設計的分子標記與蠟質缺失性狀100%連鎖。Dong 等（2019）結合BSA 法對甘藍顯性蠟質缺失基因BoGL-3進行了精細定位，將BoGL-3定位于8 號染色體末端33.5 kb的區間內，開發了1 個與顯性蠟質缺失性狀緊密連鎖的SSR 標記，將該區間內與擬南芥CER1同源的基因Bol018504確定為候選基因，該基因在顯性蠟質缺失突變體中的表達受到嚴重抑制。這些蠟質缺失基因的克隆及標記的開發為無蠟粉亮綠甘藍材料的篩選和創制奠定了基礎。

2.4 甘藍雄性不育基因的克隆

雄性不育是指植物雄性生殖器官不能產生正常有活力花粉的現象，雄性不育突變體在甘藍雜種優勢利用中發揮著重要作用，同時也是研究植物生殖發育調控的重要材料。Ji 等（2017）通過比較基因組學和轉錄組學分析，將BoCYP704B1確定為甘藍83121A 隱性雄性不育的候選基因，測序發現83121A 突變體BoCYP704B1基因中插入了1 個反轉錄轉座子，抑制了該基因表達，同時也改變了其轉錄剪切位點，根據突變位點設計的引物與不育性狀100%連鎖，可用于不育材料的輔助選擇。Han等（2018）通過圖位克隆技術將甘藍隱性核雄性不育基因ms3定位在C01 號染色體187.5 kb 的區間內，并將BoTPD1確定為ms3的候選基因。研究發現，雄性不育突變體的BoTPD1基因中有一段182 bp 片段的插入，根據該變異位點設計的分子標記與雄性不育性狀100%連鎖，可用于雄性不育材料的輔助選擇。此外，Han 等（2019）在顯性不育基因Ms-cd1定位的基礎上，基于重測序數據開發了1 個與顯性不育性狀緊密連鎖的KASP 分子標記，可用于顯性不育基因位點的快速鑒定。以上雄性不育基因的克隆和標記的開發為優良雄性不育材料的鑒定和創制提供了依據。

2.5 甘藍小孢子胚胎發生能力QTL 定位

目前關于甘藍游離小孢子培養體系的研究已取得較大進展，但是與小孢子胚胎發生相關遺傳機制的研究較少。蘇賀楠（2020）通過對高出胚甘藍材料01-88 和難出胚甘藍材料02-12 的雜交一代進行游離小孢子培養構建了包含109 個DH 系的群體，對該群體進行出胚率、表型鑒定及遺傳分析，發現甘藍小孢子的胚胎發生能力是由多個基因控制的數量性狀。通過QTL-seq 分析發現甘藍3 號染色體57.4～58.4 Mb 的區間內存在控制甘藍胚胎發生能力的QTL 位點，進一步構建遺傳圖譜進行遺傳連鎖分析，將控制甘藍出胚性狀的主效QTL 定位在3號染色體54.1～57.7 Mb 的區間內，該區間LOD 值為2.5～3.6，最高可解釋14.6%的表型變異。該研究為甘藍胚胎發生相關基因的鑒定和克隆提供了理論依據。

3 甘藍新品種選育

“十三五”期間，為滿足甘藍生產和多樣化消費的需求，培育出一批生產上急需的抗枯萎病/黑腐病、耐抽薹、耐裂球、耐熱/耐寒、品質優良的甘藍新品種，部分完成登記和獲得植物新品種權的品種見表1。例如中甘628、中甘828、中甘56、中甘1305、京甘4 號、京甘5 號、西園秋豐、西園冬秀、春秋婷美、蘇甘65 等（曾愛松 等，2017；王神云 等，2018；張揚勇 等，2018，2020；呂紅豪 等，2019）。這些新品種在產量、品質、抗病、抗逆等方面較原有品種有了顯著提升，具有良好的推廣應用前景。其中，中甘628、中甘828、京甘4 號等優良抗枯萎病新品種已大面積應用，累計在枯萎病危害嚴重地區推廣逾6.67 萬hm2（100 萬畝），減少了農藥用量及栽培成本。這些品種的推廣基本滿足了我國甘藍周年栽培、周年供應和產品類型多樣化的需求。

續表

4 問題與展望

4.1 進一步加強種質資源搜集工作和優異種質創新

種質資源是育種工作的基礎，目前我國甘藍種質資源還不夠豐富，特別是抗黑腐病和根腫病等優異種質資源匱乏。今后應繼續從國內外廣泛搜集優良種質資源，并深入開展種質資源的鑒定和評價工作。此外，應用現代高新技術與常規育種技術相結合進行甘藍種質創新，是加快新品種培育，提升甘藍育種水平的基礎性工作。

4.2 加強應用基礎和育種技術研究，提升甘藍育種水平

我國現階段甘藍育種中基礎研究相對薄弱，特別是抗病育種基礎研究有待進一步加強，例如根腫病、黑腐病等生理小種分化十分復雜，目前尚未創建精確的生理小種鑒別方法，且甘藍根腫病、黑腐病抗性基因研究主要處于QTL 定位階段。后續應進一步加大對基礎研究的投入力度，在建立精確的根腫病、黑腐病生理小種鑒別體系的基礎上，加快抗病基因的克隆。同時，要更加重視常規育種技術與生物技術的結合，進一步通過小孢子培養、遠緣雜交和基因編輯等技術創制符合市場需求的優異育種材料，為今后高競爭力甘藍新品種培育奠定堅實的材料基礎。

4.3 根據生產和市場需求培育新品種

近年來，隨著我國蔬菜產業的發展，甘藍生產面積也迅速增加。隨著市場需求、生產基地及茬口的變化，對甘藍育種提出了更多新的需求。一方面，為實現甘藍多個季節栽培和周年供應，要重視選育不同球形、不同熟性，適于春、夏、秋、冬多茬栽培的品種；另一方面，隨著甘藍規模化生產基地的建立，公司+農戶的產銷方式已經形成，即農戶生產，公司收購，遠距離運往市場銷售，因此也要重視培育適于優勢產區規模化生產基地的耐裂球、耐貯運的甘藍品種。此外，還要有目的地了解國外市場需求，培育適應某些特定國家或地區需求的甘藍品種，使我國培育的甘藍品種逐漸打入國外市場。