中藥材鹿心分子鑒定方法及檢測(cè)試劑的研究

王艷雙，姜海瀛，劉美琳，高麗君，李明成, 3，孫麗媛，張麗華，艾金霞, 3*

中藥材鹿心分子鑒定方法及檢測(cè)試劑的研究

王艷雙1, 3，姜海瀛2，劉美琳1，高麗君2，李明成2, 3，孫麗媛2，張麗華4，艾金霞2, 3*

1. 北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013 2. 北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013 3. 北華大學(xué) 吉林省中藥DNA指紋檢測(cè)技術(shù)科技創(chuàng)新中心，吉林 吉林 132013 4. 吉林雷寧食品藥品檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，吉林 吉林 132013

建立中藥材鹿心DNA指紋鑒定方法，研發(fā)鹿心DNA檢測(cè)試劑盒。以梅花鹿和馬鹿mtDNA基因作為靶基因，設(shè)計(jì)小片段特異性引物，研制鹿心DNA提取及PCR檢測(cè)試劑；應(yīng)用分子克隆及測(cè)序技術(shù)，克隆鹿心對(duì)照藥材；并對(duì)試劑的特異性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及靈敏度進(jìn)行考察；對(duì)市售鹿心樣品進(jìn)行真?zhèn)舞b定。自主研發(fā)的試劑提取鹿心的DNA濃度純度均達(dá)到PCR的要求；在退火溫度為63 ℃時(shí)引物的特異性最強(qiáng)；克隆測(cè)序后的鹿心DNA序列與鹿心mtDNA特異指紋區(qū)段序列一致；自主研發(fā)的試劑重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，靈敏度達(dá)到0.5%；對(duì)市售30個(gè)鹿心樣品進(jìn)行檢測(cè)，偽品率為40%。建立的鹿心DNA指紋鑒定方法特異、準(zhǔn)確、可靠，研制的鹿心DNA檢測(cè)試劑盒操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定。

鹿心；DNA指紋鑒定；DNA檢測(cè)試劑盒；分子克??；測(cè)序技術(shù)

鹿心為為哺乳綱偶蹄目鹿科鹿屬動(dòng)物梅花鹿Temminck或馬鹿Linnacus的心臟[1]。鹿心為吉林省的習(xí)用藥材，收載在《吉藥管注字》［2000］第132號(hào)。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為鹿心具有養(yǎng)氣補(bǔ)血、安神的功效，以鹿心為主要原料的“心腦康膠囊”（國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)Z20063078），用于冠心病、心絞痛及腦動(dòng)脈硬化癥療效顯著[2-3]。由于鹿心藥效獨(dú)特，療效確切，其市場(chǎng)價(jià)格也較高，大量偽品和混淆品（多為性狀相似的豬心、馬心、牛心、羊心等）以假亂真現(xiàn)象嚴(yán)重，影響著人們的生命安全。

中藥材傳統(tǒng)的鑒定方法包括基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定，容易受主觀因素及加工炮制的影響[4]，市售鹿心多為炮制過(guò)的干燥品，目前，鹿心尚無(wú)法定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，亦無(wú)明確的功效成分，很難通過(guò)傳統(tǒng)方法進(jìn)行鑒定。中藥材品種的差異性歸根結(jié)底是由物種的遺傳物質(zhì)DNA的不同引起的，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，依據(jù)DNA在不同生物個(gè)體的差異來(lái)鑒別生物物種的分子鑒定技術(shù)正逐步成為中藥鑒定的主要手段?！吨袊?guó)藥典》2020年版一部收錄了川貝母、烏梢蛇、金錢(qián)白花蛇以及蘄蛇的分子鑒定方法[5-8]。植物類(lèi)中藥材如紫蘇、獨(dú)活、西洋參、當(dāng)歸、絞股藍(lán)、紅景天、浙貝母等的分子鑒定有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9-15]，鹿源類(lèi)中藥材的分子鑒定如鹿茸、鹿血、鹿鞭、鹿胎的研究也有相關(guān)報(bào)道[16-19]，但是鹿心的分子鑒定及檢測(cè)試劑的研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

因此，本研究利用鹿心、豬心、馬心、牛心、羊心、驢心在DNA水平上的差異，以梅花鹿和馬鹿線粒體DNA細(xì)胞色素b（mtDNA）基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)小片段的特異性引物，采用PCR技術(shù)、分子克隆及測(cè)序技術(shù)，建立中藥材鹿心DNA指紋鑒定方法，在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出鹿心DNA檢測(cè)試劑盒，在分子水平上為鹿心真?zhèn)舞b定提供一種標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的檢驗(yàn)方式。

1 材料與儀器

1.1 材料

鹿心對(duì)照藥材、鹿心干燥樣品（梅花鹿鹿心1、2，馬鹿鹿心1、2，60～80 ℃烘烤）均由白城市食品藥品檢驗(yàn)所提供，豬心、馬心、牛心、羊心、驢心購(gòu)自吉林市食品市場(chǎng)（60～80 ℃烘烤后備用）。DL100bp Marker、DNA回收試劑盒、pGM-T載體連接試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、氨芐青霉素（Ampicillin， Amp）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β--半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl β--galactoside- gal）、異丙基-β--硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl- β--thiogalactopyranoside，IPTG）、2×Taq PCR Master Mix均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；引物由上海生物工程有限公司合成。市售鹿心樣品信息見(jiàn)表1。

1.2 儀器

D3024R型高速冷凍離心機(jī)（SCILOGEX公司，美國(guó)）；D1008E型掌上離心機(jī)（大龍創(chuàng)興實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；T100型PCR儀（美國(guó)BIORAD公司）；電泳儀、電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；UV WHITE-2020D型紫外凝膠成像分析儀（美國(guó)BIORAD公司）；微量核酸蛋白分析儀：美國(guó)Quawell（6000＋）；千分之一的電子天平、萬(wàn)分之一的電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；ZKW-C型恒溫水浴鍋（上海樹(shù)立儀器儀表有限公司）。

2 方法

2.1 鹿心DNA提取檢測(cè)試劑盒的設(shè)計(jì)

試劑盒為20次用量，由7部分組成，包括DNA提取和PCR擴(kuò)增（表1）。

表1 自主研發(fā)DNA提取及PCR檢測(cè)試劑盒的組成及特征

2.2 基因組DNA的提取及質(zhì)量鑒定

2.2.1 自主研發(fā)的試劑盒法提取的基因組DNA取供試樣品5 g，置乳缽中，充分研磨使成粉末，取樣品粉末100 mg置1.5 mL離心管中；加入P1細(xì)胞裂解液500 μL［1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）1 mL，0.5 mol/L EDTA 2 mL，NaCl 0.58 g，10% SDS 10 mL，20 mg/mL蛋白酶K 1 mL，加雙蒸水定容至100 mL；RNA 酶 5 μL］，充分混勻，在55 ℃水浴保溫1 h；加到DNA純化柱中，10 000 r/min離心3 min，棄去過(guò)濾液，加入P2洗脫液600 μL［5 mol/L KAc 26 μL，l mol/L Tris-HCI（pH 7.5）18 μL，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）3 μL，無(wú)水乙醇 480 μL，無(wú)菌雙蒸水73 μL］，10 000 r/min離心1 min；棄去過(guò)濾液，反重復(fù)洗脫2次，棄去過(guò)濾液，再離心2 min；將DNA純化柱轉(zhuǎn)移入另一離心管中，加入P3無(wú)菌雙蒸水100 μL，室溫放置10～20 min后，10 000 r/min離心2 min；離心液即供試品DNA溶液，置?20 ℃保存?zhèn)溆?。另取鹿心?yáng)性對(duì)照藥材100 mg，同法制成陽(yáng)性對(duì)照藥材模板DNA溶液。

2.2.2 基因組DNA濃度及純度的測(cè)定 將上述提取的模板DNA原溶液1 μL，加樣到微量核酸蛋白分析儀的加樣孔上，使用計(jì)算機(jī)分析軟件自動(dòng)呈現(xiàn)出260 nm和280 nm的吸光度（）值、核酸的純度（260/280）值以及核酸濃度值（260×50 ng/μL）。

2.3 PCR擴(kuò)增對(duì)鹿心引物特異性的檢測(cè)

以“2.1”項(xiàng)提取的DNA為模板，利用鹿心基因特異性鑒別引物F：5’-TCATCGCAGCAC- TCGCTATAGTACACT-3’，R：5’-ATCTCCAAGC- AGGTCTGGTGCGAATAA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為194 bp，利用自主研發(fā)的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積為25 μL，包括23 μL反應(yīng)體系（PCR反應(yīng)管內(nèi)包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，Primer F（12.5 μmol/L）1 μL，Primer R（12.5 μmol/L）1 μL，ddH2O：8.5 μL）和DNA模板2 μL。利用梯度PCR儀，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性 5 min，循環(huán)反應(yīng)30次（94 ℃、30 s，55～65 ℃、30 s，72 ℃、30 s），延伸72 ℃、5 min。另取無(wú)菌ddH2O，作為空白對(duì)照。并同時(shí)利用基因通用引物[14]正向：5’-TACCATGAGGAC- AAATTACATTCTG-3’，反向：5’-CCTCCTAGTT- TGTTAGGGATTGATCG-3’，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約500 bp。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5min，循環(huán)反應(yīng)34次（94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、30 s），延伸72 ℃、5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，使用1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR結(jié)果。

2.4 鹿心對(duì)照藥材的克隆及測(cè)序

取50 μL鹿心對(duì)照藥材的特異性PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目的基因；將目的基因與pGM-T載體連接，16 ℃過(guò)夜，組成重組子；碎冰上將重組子轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，增殖4 h后取菌液30 μL涂布于含Amp、-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜，進(jìn)行藍(lán)-白斑篩選陽(yáng)性重組子；挑選白色菌落，放入含Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h，次日提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證為陽(yáng)性重組體，送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。樣品均采用正、反2個(gè)引物雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分別與每一個(gè)樣品靶基因進(jìn)行比對(duì)分析。擴(kuò)增區(qū)域DNA序列與靶基因特異性指紋區(qū)段DNA序列同源性為100%，確定為鹿心DNA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液。

2.5 DNA提取試劑的性能評(píng)價(jià)

2.5.1 重現(xiàn)性試驗(yàn) 選取鹿心正品和同一批次的提取DNA試劑，分別在3個(gè)實(shí)驗(yàn)室，由3位技術(shù)人員提取基因組DNA，每人重復(fù)5次，對(duì)DNA的完整性、濃度及純度進(jìn)行分析，觀察DNA提取試劑的重現(xiàn)性。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 利用SPSS17.0分析軟件，對(duì)重現(xiàn)性分析所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并計(jì)算RSD，觀察DNA提取試劑的穩(wěn)定性。

2.6 PCR檢測(cè)試劑的性能評(píng)價(jià)

2.6.1 特異性試驗(yàn) 對(duì)鹿心正品及其易混品基因組DNA進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，觀察引物的特異性。

2.6.2 重現(xiàn)性試驗(yàn) 對(duì)鹿心正品及其易混品分別在3個(gè)實(shí)驗(yàn)室，由3位技術(shù)人員檢測(cè)相同樣品，觀察試劑的重現(xiàn)性。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 隨機(jī)挑選1個(gè)試劑盒分別在試劑配制的第3、6、9、12個(gè)月，對(duì)鹿心正品基因組DNA進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，觀察試劑的穩(wěn)定性。

2.6.4 靈敏性試驗(yàn) 鹿心對(duì)照藥材初始樣本量分別為100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 mg，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑的靈敏度。

2.7 自主研發(fā)的試劑盒檢測(cè)市售鹿心樣品

使用自主研發(fā)的鹿心DNA指紋檢測(cè)試劑盒，對(duì)市售30個(gè)鹿心樣品進(jìn)行真?zhèn)蔚蔫b定，并與白城市食品藥品檢驗(yàn)所鑒定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 基因組DNA的提取及質(zhì)量鑒定結(jié)果

自主研發(fā)試劑提取出鹿心基因組DNA，通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定260/280值在1.7～1.9，計(jì)算出的質(zhì)量濃度為120～150 ng/μL，達(dá)到PCR實(shí)驗(yàn)的要求（表2）。

表2 鹿心正品及其偽品DNA純度及濃度檢測(cè)結(jié)果

3.2 PCR擴(kuò)增對(duì)鹿心引物特異性的檢測(cè)

利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，鹿心對(duì)照藥材和鹿心正品均在194 bp處有1條特異性擴(kuò)增條帶，偽品及空白對(duì)照均無(wú)條帶；利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，大約在500 bp所有的樣品均出現(xiàn)1條條帶，空白對(duì)照無(wú)條帶（圖1）。

3.3 鹿心標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液的克隆及測(cè)序結(jié)果

經(jīng)過(guò)分子克隆藍(lán)-白斑篩選，氨芐陽(yáng)性平皿出現(xiàn)藍(lán)-白菌落（圖2）。挑區(qū)白色菌落培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)特異性引物PCR擴(kuò)增驗(yàn)證條帶的位置（圖3）。將鹿心質(zhì)粒DNA送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)分析結(jié)果顯示，特異性引物擴(kuò)增區(qū)域DNA序列與梅花鹿基因特異性指紋區(qū)段DNA序列完全一致，同源性為100%，與馬鹿基因特異性指紋區(qū)段DNA序列同源性為96%，與其他偽品序列比對(duì)結(jié)果均顯示沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的相似性。因此將梅花鹿鹿心DNA克隆液確定為鹿心DNA陽(yáng)性對(duì)照液（圖4），裝入鹿心DNA指紋檢測(cè)試劑盒中。

圖2 鹿心DNA分子克隆藍(lán)--白斑篩選圖

3.4 DNA提取試劑的性能評(píng)價(jià)

3.4.1 重現(xiàn)性試驗(yàn) 紫外分光光度法檢測(cè)提取的基因組DNA，純度在1.7～1.9，質(zhì)量濃度在130～150 ng/μL。表明自主研發(fā)的鹿心DNA提取試劑重現(xiàn)性良好。

3.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) （1）組內(nèi)分析：第1組基因組DNA的純度（1.789±0.029），RSD為1.60%，DNA的質(zhì)量濃度（148.190±2.219）ng/μL，RSD為1.49%；第2組基因組DNA的純度（1.778±0.040），RSD為2.28%，DNA的質(zhì)量濃度（141.070±2.837）ng/μL，RSD為2.01%；第3組基因組DNA的純度（1.809±0.031），RSD為1.74%，DNA的質(zhì)量濃度（147.78±3.930）ng/μL，RSD為2.66%。（2）組間分析：基因組DNA的純度（1.792±0.035），RSD為1.96%，DNA的質(zhì)量濃度（145.68±4.510）ng/μL，RSD為3.10%?？梢?jiàn)無(wú)論組內(nèi)和組間的標(biāo)準(zhǔn)差和RSD都很小，表明各組數(shù)據(jù)非常接近，離散度非常低。證實(shí)自主研發(fā)的鹿心DNA提取試劑穩(wěn)定性良好。

圖4 鹿心質(zhì)粒DNA測(cè)序與梅花鹿mtDNA Cytb基因比對(duì)結(jié)果

3.5 PCR檢測(cè)試劑的性能評(píng)價(jià)

3.5.1 特異性試驗(yàn) 使用自主研發(fā)的鹿心DNA指紋檢測(cè)試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，鹿心對(duì)照液（A）、鹿心對(duì)照藥材（B）和鹿心樣品均在194 bp處有1條特異性擴(kuò)增條帶，而豬心、牛心、馬心、羊心、驢心及空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。

3.5.2 重現(xiàn)性試驗(yàn) 使用自主研發(fā)的鹿心DNA指紋檢測(cè)試劑盒，由3個(gè)實(shí)驗(yàn)室的3個(gè)技術(shù)人員進(jìn)行試驗(yàn)，鹿心對(duì)照液、鹿心對(duì)照藥材和鹿心樣品均在194 bp處有一條特異性擴(kuò)增條帶，而豬心、牛心、馬心、羊心、驢心樣品及空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。

3.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 使用自主研發(fā)的鹿心DNA指紋檢測(cè)試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，試劑配制后的3、6、9、12個(gè)月鹿心對(duì)照液、鹿心對(duì)照藥材和鹿心樣品均在194 bp處有1條特異性擴(kuò)增條帶，而空白對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。

3.5.4 靈敏度試驗(yàn) 使用自主研發(fā)的鹿心DNA指紋檢測(cè)試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，隨著樣品取樣量的減少，PCR產(chǎn)物條帶的亮度逐漸降低，取樣量為0.5 mg時(shí)，PCR產(chǎn)物條帶清晰可見(jiàn)，取樣量低于0.5 mg時(shí)，PCR產(chǎn)物條帶均隱約可見(jiàn)模糊不清。因此，自主研發(fā)的鹿心DNA指紋檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的靈敏度為0.5%。

3.6 自主研發(fā)的試劑盒檢測(cè)市售鹿心樣品檢測(cè)結(jié)果

使用自主研發(fā)的鹿心DNA指紋檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，市售30個(gè)鹿心樣品，18個(gè)是正品（有特異條帶），12個(gè)是偽品（無(wú)特異條帶），偽品率為40%。與白城市食品藥品檢驗(yàn)所鑒定結(jié)果一致（圖5）。

M-Marker P-鹿心陽(yáng)性對(duì)照液 1～30-同表1樣品編號(hào) N-空白對(duì)照

4 討論

中藥材基原真?zhèn)舞b別是中藥學(xué)研究領(lǐng)域中的重要研究方向和首要問(wèn)題，中藥材是否“正本清源”直接影響到用藥安全。對(duì)中藥材基原鑒別可以從源頭上控制中藥的質(zhì)量，對(duì)保障中藥生產(chǎn)和中藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展起到舉足輕重的作用[20]。

線粒體DNA作為細(xì)胞核外遺傳信息載體，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、不含間隔區(qū)、不含內(nèi)含子、無(wú)重復(fù)序列、母系遺傳、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，是研究物種群體分子分類(lèi)、遺傳結(jié)構(gòu)、分子系統(tǒng)發(fā)育的理想分子標(biāo)記[21-22]。Cytb是線粒體DNA唯一參與線粒體呼吸鏈電子傳遞的細(xì)胞色素，Cytb進(jìn)化速度適中，含有豐富的SNP位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，適用于動(dòng)物種屬間差異和進(jìn)化關(guān)系的研究分析[23-26]。作為有效的分子遺傳學(xué)標(biāo)記是目前研究的熱點(diǎn)，極大地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒定的不足。

本研究考慮干燥鹿心樣品是經(jīng)高溫烘烤而成，會(huì)導(dǎo)致DNA降解嚴(yán)重，同時(shí)根據(jù)各樣品基因SNP位點(diǎn)的差異，設(shè)計(jì)小片段194 bp的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在退火溫度為63 ℃時(shí)引物特異性最強(qiáng)，引物只與鹿心的基因的指紋區(qū)段特異性結(jié)合，擴(kuò)增出大量的產(chǎn)物，在194 bp處出現(xiàn)一條特異性條帶；但是，在此溫度時(shí)，引物不會(huì)與其他偽品的指紋區(qū)段結(jié)合，因此偽品與空白對(duì)照均無(wú)條帶。利用鹿心基因特異性引物，只要優(yōu)化好引物的退火溫度，就可以準(zhǔn)確地鑒定出鹿心的真?zhèn)?。而如果是通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，正品與偽品均會(huì)出現(xiàn)一樣的條帶，無(wú)法區(qū)分，就必須進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，RCP-RFLP）。如果就是用來(lái)區(qū)分鹿心與不同種屬的偽品，本研究建立的鑒定方法簡(jiǎn)單易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，完全可以區(qū)分。但是如果區(qū)分同種屬的樣本如梅花鹿鹿心與馬鹿鹿心，那么RCP-RFLP還是很有優(yōu)勢(shì)的，如王鳳霞等[16]對(duì)鹿血的PCR-RFLP鑒定研究。因?yàn)楸狙芯繕悠仿剐闹傅木褪敲坊古c馬鹿的心臟，所以不用細(xì)分，因此本研究建立的鹿心DNA指紋鑒定方法只要與不同種屬的偽品區(qū)分開(kāi)來(lái)即可。

運(yùn)用DNA序列分析對(duì)比法對(duì)未知樣品是否屬于某一特定物種是最可靠的，最令信服的鑒定方法[27-28]。為了驗(yàn)證引物的特異性以及擴(kuò)增的特異性基因片段序列的正確性，對(duì)鹿心對(duì)照藥材特異性PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆和基因序列測(cè)定，比對(duì)結(jié)果與梅花鹿特異的指紋區(qū)段DNA序列完全一致，同源性為100%；與馬鹿特異的指紋區(qū)段DNA序列同源性高達(dá)96%，有8個(gè)堿基存在差異，表明在種的水平上該指紋區(qū)段進(jìn)化是保守的；而與其他偽品序列比對(duì)均顯示沒(méi)有明顯的相似性。表明本研究建立的鹿心DNA指紋鑒定方法具有特異性、可行性和可靠性，并且驗(yàn)證了如果是同種屬樣本的鑒定RCP-RFLP的優(yōu)勢(shì)。因此將梅花鹿鹿心克隆液作為鹿心對(duì)照液裝進(jìn)試劑盒中。

本研究根據(jù)建立了鹿心DNA指紋鑒定方法，進(jìn)而研制出鹿心DNA指紋檢測(cè)試劑盒，從特異性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及靈敏度4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，性能良好。并且對(duì)市售30個(gè)鹿心樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果18個(gè)正品，12個(gè)偽品，偽品率為40%，實(shí)用性強(qiáng)。本試劑盒，包括DNA提取試劑、PCR檢測(cè)試劑和陽(yáng)性對(duì)照藥材DNA克隆液，只需按照操作流程約4 h就可以快速、準(zhǔn)確地完成鹿心真?zhèn)蔚蔫b定，實(shí)現(xiàn)了鹿心分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，達(dá)到可以推廣的條件。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Glenn T C, Ojerio R S, Braun M J. Microsatellite DNA loci for genetic studies of cranes [J]., 1997, 7: 36-45.

[2] Ellegren H, Chowdhary B P, Johansson M,. Primary linkage map of the genome revealsa low rate of genetic recombination [J]., 1994, 137: 1089-1100.

[3] 徐吉臣, 朱立煌. 遺傳圖譜中的分子標(biāo)記 [J]. 生物工程進(jìn)展, 1992, 12(5): 1-3.

[4] 張軍, 鄧偉, 張進(jìn), 等. 心腦康膠囊聯(lián)合曲美他嗪治療冠心病心絞痛的臨床研究 [J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2017, 32(1): 25-29.

[5] 中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020：38-39.

[6] 中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020：80-81.

[7] 中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020：229.

[8] 中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020：388-389.

[9] 夏至, 李賀敏, 張紅瑞, 等. 紫蘇及其變種的分子鑒定和親緣關(guān)系研究 [J]. 中草藥, 2013, 44(8): 1027-1032.

[10] 魏曉雨, 田義新, 趙智靈, 等. 不同產(chǎn)地西洋參種質(zhì)遺傳多樣性的RAPD和ISSR分析 [J]. 中草藥, 2014, 45(21): 3153-3158.

[11] 孫稚穎, 姚輝. 不同產(chǎn)地菘藍(lán)ISSR分析與鑒定 [J]. 中草藥, 2014, 45(22): 3323-3326.

[12] 李敏, 黃龍妹, 趙欣, 等. 浙貝母特異性PCR鑒定方法研究 [J]. 中草藥, 2014, 45(12): 1754-1757.

[13] 朱田田, 晉玲, 張裴斯, 等. 基于ISSR的甘肅不同產(chǎn)區(qū)栽培當(dāng)歸遺傳多樣性研究 [J]. 中草藥, 2015, 46(23): 3549-3557.

[14] 李華, 史美榮, 肖婭萍. 絞股藍(lán)種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系的ISSR分析 [J]. 中草藥, 2015, 46(11): 1666-1672.

[15] 王夢(mèng)亮, 任曉琳, 崔晉龍, 等. 野生紅景天的RAPD和ISSR遺傳多樣性分析 [J]. 中草藥, 2016, 47(3): 469-473.

[16] 王鳳霞, 陳媛媛, 任貴奇, 等. 鹿血的PCR-RFLP鑒定研究 [J]. 中草藥, 2018, 49(8): 1914-1918.

[17] 白根本, 張林源, 劉春生, 等. 鹿源類(lèi)中藥材DNA序列分析及馬鹿和梅花鹿的PCR鑒定 [J]. 中草藥, 2006, 37(10): 1566-1569.

[18] 劉向華, 王義權(quán), 周開(kāi)亞, 等. 鹿類(lèi)中藥材的位點(diǎn)特異性PCR鑒定研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 36(8): 631-635.

[19] 黃璐琦, 袁媛, 蔣超, 等. 一種基于PCR-RFLP鑒定中藥材鹿茸的方法, 中國(guó): CN105176988A [P]. 2015- 12-23.

[20] 李西林, 陳科力, 李薇, 等. 試析中藥鑒定中的基原鑒定問(wèn)題 [J]. 中藥材, 2009, 32(12): 1929-1932.

[21] Augot D, Ninio C, Akhoundi M,. Characterization of two cryptic species,and(Diptera: Ceratopogonidae), based on barcode regions and morphology [J]., 2013, 38(2): 260-265.

[22] 王健勝, 高雅琴. 基于Cytb基因的動(dòng)物檢材種屬鑒定在非傳統(tǒng)領(lǐng)域的部分運(yùn)用 [J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2010(1): 37-43.

[23] Wang Y S, Yuan G X, Zhang L H,. Establishment of mink heart identification method based on mitochondrial cytochrome b gene and development of its detection kit [J]., 2019, 30(2): 325-331.

[24] 高麗君, 何程遠(yuǎn), 李盈諾, 等. 基于雙重PCR技術(shù)的鹿茸及其偽品DNA指紋特征和鑒定 [J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2018, 44(4): 839-844.

[25] Smerkova K, Vaculovic T, Vaculovicova M,. DNA interaction with platinum-based cytostatics revealed by DNA sequencing [J]., 2017, 539: 22-28.

[26] 曲曉娟，李昭燕，宋倩，等. 基于線粒體DNA序列分析研究泰山赤鱗魚(yú)的分類(lèi)和進(jìn)化[J]. 山東理工大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2017, 31(5): 18-23.

[27] Marco C. The mitochondrial genome, a growing interest inside an organelle [J]., 2008, 16: 51-57.

[28] Petrovskaya A V. Genetic structure of the sableL. populations from Magadan oblast as inferred from mitochondrial DNA variation [J]., 2007, 43(4): 424-429.

Study on molecular identification method and detection reagent of Chinese medicinal materials deer heart

WANG Yan-shuang1,3, JIANG Hai-ying2, LIU Mei-lin1, GAO Li-jun2, LI Ming-cheng2,3, SUN Li-yuan2, ZHANG Li-hua4, AI Jin-xia2,3

1. Medical College, Beihua University, Jilin 132013,China 2. School ofMedical Technology, Beihua University, Jilin 132013,China 3. Chinese Medicine DNA Fingerprint Detection Technology Innovation Center, Beihua University, Jilin 132013, China 4. Jilin Leining Food and Drug Testing Technology Service Co., Ltd., Jilin 132013, China

To establish a DNA fingerprint identification method for Chinese medicinal materials deer heart and develop DNA detection kit for deer heart.Using the mtDNAgene ofandas the target gene, small fragment specific primers were designed and used to develop the deer heart DNA extraction reagent and PCR detection reagent. Using molecular cloning and the sequencing technology,standard materials to deer heart was cloned. And then the specificity, reproducibility, stability and sensitivity of the reagent was investigated. Finally the authenticity of the commercial deer heart samples was verified.The concentration and purity of DNA extracted by the self-developed reagent reached the requirement of PCR. The specificity of the primer was the strongest when the annealing temperature was 63 ℃. The DNA sequence of deer heart after cloning was consistent with the specific fingerprint section of sika deer heart mtDNAgene. Self-developed reagent had good reproducibility, stability and sensitivity up to 0.5%. Thirty baked deer heart samples for sale were tested and the rate of counterfeitwas 40%.The DNA fingerprint identification method of deer heart established in this study is specific, accurate and reliable. The DNA detection kit for deer heart which developed in this study is simple to use and the result is stable.

deer heart; DNA fingerprint identification method; DNA detection kit; molecular cloning; sequencing technology

R282.2

A

0253 - 2670(2021)02 - 0544 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.028

2020-06-09

吉林省發(fā)改委項(xiàng)目（2018C048-2）；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20180201023YY，20190303093SF，20190301014NY，20200404152YY，20200403047SF）；吉林省科技創(chuàng)新中心建設(shè)項(xiàng)目（20190902018TC）

王艷雙，女，博士，副教授，研究方向?yàn)槭称芳八幤稤NA指紋技術(shù)研究與應(yīng)用。E-mal: wangys5521@163.com

艾金霞，女，碩士，教授，研究方向?yàn)槭称芳八幤稤NA指紋技術(shù)研究與應(yīng)用。E-mal: 1047085280@qq.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]