荊芥1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆及生物信息學分析

林谷音，周佩娜，尹夢嬌，劉莉成，戴仕林，劉潺潺*，吳啟南, 3*

? 藥材與資源 ?

荊芥1-脫氧--木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆及生物信息學分析

林谷音1, 2，周佩娜1，尹夢嬌1, 2，劉莉成1, 2，戴仕林1, 2，劉潺潺1, 2*，吳啟南1, 2, 3*

1. 南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023 2. 江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心，江蘇 南京 210023 3. 中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心，江蘇 南京 210023

克隆荊芥1-脫氧--木酮糖-5-磷酸合成酶（1-deoxy--xylulose 5-phosphate synthase，）基因，并進行生物信息學分析。根據荊芥轉錄組數據獲得的基因序列設計特異性引物，通過RT-PCR技術獲得基因cDNA的全長序列，并進行生物信息學分析。荊芥基因全長2177 bp，包含一個長度為2157 bp的開放閱讀框，編碼718個氨基酸，其理論相對分子質量為77 240，等電點為6.32，定位于葉綠體，不存在跨膜區及信號肽，為非分泌蛋白。同源系統進化樹分析表明，該序列與同科植物鼠尾草的基因進化關系較近，均屬于1亞家族。密碼子偏性分析表明，該基因偏好使用以A/T結尾的密碼子，具有28個偏性密碼子，煙草為該基因最適合的外源表達宿主。成功克隆荊芥基因并進行生物信息學分析，為從分子水平調控荊芥的生長發育和改善藥材產量和品質提供理論基礎。

荊芥；1-脫氧--木酮糖-5-磷酸合成酶；基因克隆；生物信息學分析；RT-PCR

中藥荊芥為唇形科一年生草本植物荊芥Briq. 的干燥地上部分，具有解表散風、透疹、消瘡的功效。其莖、葉、花穗多個部位富含揮發油，經提取可得到荊芥精油，被廣泛用于醫藥、化工、食品和香料等領域。荊芥精油主要含有單萜類成分，也含有少量倍半萜和醛、酮、醌類等化合物，其中薄荷酮（menthone）、胡薄荷酮（pulegone）相對含量較高，占總揮發油含量的70%以上[1]，具有鎮痛、抗炎以及體內抗病毒活性[2,3]。

單萜類成分在植物體內主要通過2-甲基--赤蘚醇-4-磷酸途徑（MEP Pathway）合成，該途徑以丙酮酸（pyruvate）和3-磷酸-甘油醛（glyceraldehyde-3-phosphate）為原料，經過多步酶促反應生成異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和其異構體二甲丙烯焦磷酸（dimethylally pyrophosphate，DMAPP），再進一步生成牻牛兒基焦磷酸（geranyl pyrophosphate，GPP），人們熟知的樟腦、檸檬烯、薄荷酮均是GPP的下游產物——單萜類成分[4-5]。1-脫氧--木酮糖-5-磷酸合酶（1-deoxy--Xylulose- 5-phosphate synthase，DXS）是MEP途徑的限速酶之一，是催化丙酮酸和3-磷酸-甘油醛合成1-脫氧--木酮糖-5-磷酸（1-deoxy--xylulose 5-phosphate，DXP）的關鍵酶[6-7]。目前，基因已在厚樸[8]、黃花蒿[9]、滇龍膽[10]、冬凌草[11]等多種藥用植物中被分離并鑒定，發現該基因在調節植物生長發育、次生代謝產物的合成與積累以及自身保護和防御等方面具有重要作用。

迄今為止，有關荊芥的研究多聚焦于植物形態學、化學成分以及藥理作用方面，從分子水平層面僅報道了荊芥單萜類成分生物合成相關的-檸檬烯合酶（-limonene synthase）基因的分子克隆和酶促實驗，并推測了該酶的立體化學結構[12]，有關荊芥單萜類成分生物合成分子機制的報道依然鮮有報道。因此，本研究基于課題組前期荊芥轉錄組測序數據，篩選得到注釋為的序列，對其進行特異性引物設計和cDNA全長克隆及生物信息學分析。以期為下一步研究其功能，探索荊芥單萜類成分生物合成機制奠定基礎，也為提升中藥荊芥的藥用品質提供理論指導。

1. 材料與試劑

1.1 材料

本實驗植物材料荊芥由購買于河北的荊芥種子繁殖而得，經課題組前期培養30 d得到荊芥新鮮植株，經南京中醫藥大學吳啟南教授鑒定為唇形科荊芥屬植物荊芥Briq.，其新鮮葉片清水洗凈后用濾紙吸干水分，作為提取荊芥RNA的材料。

1.2 試劑

多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、DH5α大腸桿菌感受態細胞購于北京天根生化科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購于北京擎科新業生物技術有限公司；PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、2×Taq Master Mix、pMD18-T Vector Cloning Kit購于大連寶生物科技有限公司；2×Easy Taq Mix購于北京全式金生物技術有限公司；引物合成和測序技術服務由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

2 方法

2.1 荊芥葉片總RNA的提取及cDNA的合成

將荊芥葉片樣品置于液氮中研磨成細粉，按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，按照PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄體系進行cDNA的合成。

2.2 荊芥StDXS基因全長的克隆

根據課題組前期荊芥轉錄組數據獲得基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物，上游引物DXS-F的序列為5’-CACACAC- ACACAAGATGGCT-3’，下游引物DXS-R的序列為5’-CCATCTAGGACATCATCTC-3’。擴增體系總體積25 μL，包括2×Taq Master Mix 12.5 μL，葉cDNA模板2.5 μL，上游和下游引物各1.0 μL，ddH2O 9.0 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性1.5 min；94 ℃變性30 s；50 ℃退火45 s；72 ℃延伸5 min，共35個循環；最后72 ℃保持10 min；4 ℃永久。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用DNA凝膠回收試劑盒將目的條帶切膠回收。用TA-cloning Kit及pMD18-T載體與目的基因連接，將陽性克隆送上海生工有限公司進行測序。

2.3 StDXS基因序列的生物信息學分析

將測序后得到的基因序列通過美國國立生物技術信息中心（NCBI）中的Blast 對比。利用擬南芥在線數據庫TAIR-BLAST尋找擬南芥中的同源蛋白；使用NCBI中的Concserved Domain預測蛋白保守域及超家族；使用蛋白結構和功能預測軟件對編碼的蛋白的理化性質（ProtParam）、結構域（Inter Pro Scan）、信號肽（SignalP 4.1 Server）、亞細胞定位（WoLF-PSORT II）、跨膜結構（Tmhmm Server v.2.0）、糖基化、磷酸化位點（NetNGlyc 1.0 Server、NetPhos 3.1 Server）、蛋白親疏水性（ProtScale）、蛋白結構（Sopma，Swiss-Model）等進行綜合生物信息學分析。使用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對，使用MEME在線軟件進行氨基酸保守基序分析，利用MEGA-X 10.0的鄰接法構建系統發育樹（Neighbor-Joining，NJ），最后使用CondoW和EMBOSS軟件對該基因的密碼子偏好性進行分析。所用生物信息學在線程序見表1。

3 結果與分析

3.1 荊芥StDXS基因cDNA克隆及序列分析

本實驗提取得到的荊芥總RNA的28S和18S條帶清晰，無彌散拖尾等現象，說明總RNA質量較好。以總RNA逆轉錄得到的cDNA為模板，利用特異性引物DXS-F、DXS-R進行全長擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現在2000 bp左右出現特異片段，與該基因片段預期大小基本一致（圖1）。

將PCR產物進行TA克隆測序，發現荊芥基因序列全長為2177 bp，命名為。該序列經BLAST搜索比對后發現與唇形科植物丹參Bunge. 的基因序列相似性最高為99%，說明該序列擴增正確。利用NCBI的ORF Finder查詢功能對該序列進行分析，發現基因包含一個長為2157 bp的開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼718個氨基酸殘基（圖2）。

3.2 荊芥StDXS基因序列編碼蛋白的生物信息學分析

利用NCBI中的Concserved Domain搜索后發現基因編碼的蛋白質具有PLNO2582活性位點（45～718），屬于PLN02582超家族。利用Inter Pro Scan搜索發現StDXS蛋白質屬于脫氧木酮糖磷酸合酶（deoxyxylulose-5-phosphate synthase，IPR005477）家族，該家族主要參與萜類化合物的生物合成。StDXS含有3個結構域，分別為轉酮醇酶N端結構域（transketolase，-terminal，110～119），類轉酮酶嘧啶結合結構域（transket-pyr，397～562）和轉酮醇酶結構域（transketolase_C，576～699）。此外StDXS還具有DXS家族基因特征保守序列“DRAG”，進一步證明基因擴增的正確性。利用在線軟件Protparam對基因編碼的氨基酸序列進行分析，發現其編碼718個氨基酸殘基，分子式為C3424H5408N952O1023S30，相對分子質量為77 240，等電點為6.32，其半衰期較長，為30 h，不穩定系數為40.00，屬于穩定蛋白，脂肪族氨基酸指數為87.14，親水性總平均值為?0.089，屬于親水性蛋白。在基因編碼的氨基酸分布中，丙氨酸（Ala）含量最高為10.6%，其次是亮氨酸（Leu）為10.0%，半胱氨酸（Cys）和色氨酸（Trp）最少為1.8%和0.4%，其中負電荷殘基（Asp＋Glu）有77個，正電荷殘基（Arg＋Lys）有69個。

*為終止密碼子；陰影部分為轉酮酶結構域；下劃線部分為基因特征保守序列“DRAG”

*represents the Stop Codon; transketolase domain was marked by the shadow;the DXS signature sequence (DRAG) is underscored

圖2 荊芥蛋白質編碼區(CDS) 及其氨基酸序列

Fig. 2 Coding sequence region (CDS) ofand its amino acid sequence

利用WoLF-PSORT II在線軟件進行StDXS蛋白的亞細胞定位預測，結果表明該蛋白定位于葉綠體、細胞核、胞質的值分別為8、3、3，說明StDXS最可能定位于葉綠體；利用TMHMM Server v.2.0在線軟件預測StDXS蛋白的跨膜結構域，發現該蛋白無跨膜結構域，說明其不屬于跨膜蛋白（圖3-A）；利用NetNGlyc 1.0 Server在線軟件預測StDXS蛋白的糖基化位點，發現該蛋白有2個糖基化位點（11，106）（圖3-B）；利用NetPhos 3.1 Server預測StDXS蛋白的磷酸化位點和蛋白激酶結合位點（圖3-C），發現該蛋白共有磷酸化位點60個，其中絲氨酸（S）28個，蘇氨酸（T）23個，酪氨酸（Y）9個，并存在蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A（PKA）、絡蛋白激酶II（CKII）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI）、細胞分裂周期激酶2（CDC2）、P38信號調節蛋白激酶（p38MAPK）、unsp等多種特異性蛋白激酶結合位點。利用SignalP 4.1 Server在線軟件預測StDXS蛋白的信號肽，發現該蛋白不含信號肽，可能為非分泌蛋白（圖3-D）；利用ExPasy-ProtScale分析StDXS蛋白親/疏水性（圖3-E），發現疏水性最強出現在第602個氨基酸（A）處最高值為2.300；親水性最強出現在第176個氨基酸（E）處最低值為?2.500。從整條肽鏈的氨基酸預測值來看，其中大部分為負值，由此可以推斷，荊芥DXS蛋白是一種親水性蛋白，與蛋白質的理化性質預測一致。

3.3 荊芥StDXS基因序列編碼蛋白的二級、三級結構預測

利用SOPMA對StDXS蛋白的二級結構進行分析，結果表明該蛋白二級結構主要以α-螺旋（H）和無規卷曲（C）為主，分別為40.25%和37.47%，還存在14.48%的延伸鏈（E）和7.80%的β-轉角（T）。使用Swiss-Model在線軟件預測StDXS蛋白的三級結構，并使用Pymol對其進行可視化處理及優化（圖4）。

圖3 荊芥StDXS蛋白跨膜結構域(A)、蛋白糖基化位點(B)、蛋白磷酸化位點(C)、蛋白信號肽(D)、蛋白親水性/疏水性(E)預測

3.4 荊芥StDXS蛋白同源性及保守基序分析系統進化分析

利用NCBI中的BLASTp對基因編碼的氨基酸與其他植物DXS蛋白的氨基酸序列進行同源比對，發現其與丹參（SmDXS，ACF21004.1）、冬凌草(Hemsl.) Hara（IrDXS，AMM72794.1）、胡椒薄荷L.（MpDXS，AAC33513.1）、蓖麻L.（RcDXS，XP_002533688.1）、番茄L.（SlDXS3，XP_004245186.1）具有較高相似性，分別為96.10%、72.02%、68.84%、59.17%、56.34%，多序列分析表明荊芥、丹參、冬凌草和胡椒薄荷DXS氨基酸序列均含有DXS家族的高度保守的特殊結構域“DRAG”，蓖麻與番茄DXS氨基酸序列含有特殊結構域“TSAG”（圖5）。利用MEME在線網站分析以上6種植物DXS氨基酸序列的保守基序（motif），在值＜10，值＜0.000 1條件下，識別出16個共有的motif，長度為50、43、41、29、21、15個氨基酸各有10、1、1、1、1、2個，這些motif可能是蛋白的功能位點（圖6）。

3.5 荊芥StDXS基因系統進化分析

利用MEGA-X 10.0軟件的Neighbor-joining模式建立28種植物的StDXS氨基酸序列系統進化樹，結果表明荊芥與同科植物鼠尾草L.親緣關系較高，聚于一支（圖7）。系統進化聚類顯示植物基因分為3個亞家族1、2、3，與文獻報道一致[9,13]。

3.6 荊芥StDXS基因密碼子偏好性分析

利用CodonW和EMBOSS軟件分析荊芥基因的密碼子適應指數（codon adaptation index，CAI）、有效密碼子數（effective number of codons，ENC）、不同位置的GC含量（GC1s、GC2s、GC3s）、總GC含量、同義密碼子相對使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）。結果表明CAI為0.3176、ENC為55.083，說明密碼子偏性較弱；總GC值為0.474 7＜0.5，GC1s、GC2s和GC3s分別為0.568 8、0.445 1和0.4103，說明該基因編碼區的A/T含量高于G/C含量；當RSCU＝1時，密碼子沒有偏好性；當RSCU＞1時，密碼子具有偏好性，表2中RSCU＞1的密碼子共有28個，其中19個以A/T結尾，9個以G/C結尾，說明荊芥基因偏好于使用A或T結尾的密碼子。

利用在線軟件EMBOSS-CHIP分析荊芥基因密碼子的使用頻率，在數據庫CodonUsage Database 查找擬南芥(L.) Heynh.、煙草L.、酵母、大腸桿菌基因組的密碼子偏好性，荊芥的基因與擬南芥、煙草、酵母、大腸桿菌各密碼子使用頻率的比值分別用St/At、St/Ns、St/Sc、St/Ec表示（表3）。若2物種間的密碼子使用偏好性差異較小，該比值常在0.5～2.0，不在此范圍內則差異較大，差異較大的密碼子個數越少則說明2種物種密碼子偏好性相似，有利于基因的異源表達。荊芥基因與大腸桿菌、酵母、煙草、擬南芥偏好性差異較大的密碼子個數依次為16、15、7、9，說明煙草最適合該基因的異源表達。

不同的基序用不同顏色的方框表示

圖7 StDXS氨基酸序列系統進化分析

4 討論

芳香類藥用植物如荊芥、薄荷、紫蘇等因含揮發性成分而具有特殊的氣味，藥材記載常具有解表、化濕、行氣、開竅等功能，現代藥理學表明此類揮發性成分具有抑菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理活性，在治療發燒、炎癥、病毒性感冒等疾病上具有顯著療效[14-18]。而萜類化合物是揮發性成分發揮藥理活性的主要物質基礎。荊芥揮發性成分中萜類物質占70%，但目前荊芥精油的獲得主要依賴于新鮮植物的水蒸氣蒸餾提取，提取效率較低，且耗時較長，造成荊芥資源的浪費。有研究表明荊芥體內的胡薄荷酮和薄荷酮含量隨荊芥的生長發育呈現規律性的變化[19]，這與荊芥萜類成分生物合成途徑中關鍵酶的表達調控有著必然的聯系。因此利用分子生物學和基因編輯手段提高荊芥體內萜類物質的含量可以極大地減少荊芥資源的消耗，使其充分利用，從而為荊芥藥材資源的可持續發展提供保障。

表3 荊芥StDXS基因與大腸桿菌、酵母、煙草、擬南芥基因組密碼子使用頻率比較

本研究從荊芥中成功克隆了荊芥萜類化合物生物合成途徑上的基因，該基因cDNA全長2177 bp，包含一個長度為2157 bp的開放閱讀框。生信學分析表明基因編碼718個氨基酸殘基，理論預測蛋白質相對分子質量為77 240，等電點為6.32，屬于PLN02582超家族，含有3個轉酮醇酶結構域和DXS家族特征性保守序列“DRAG”。預測該基因的亞細胞定位于葉綠體，編碼一種非跨膜、無轉運肽的親水性蛋白。

在荊芥與其他5種植物的氨基酸序列保守基序分析中發現，其保守基序的種類和位置非常相似，同一亞組之間保守基序幾乎相同，不同亞組之間保守基序存在一定差異。系統進化樹分析發現荊芥基因屬于亞家族，同科的冬凌草和胡椒薄荷基因屬于亞家族，而蓖麻和番茄屬于亞家族，亞家族與其他2個亞家族進化關系較遠，它們的氨基酸序列存在一定差異，從而造成了功能上的差異。有研究表明基因的3個亞家族中，亞家族具有看家基因的功能，其所編碼的酶催化前體物質形成葉綠素、類胡蘿卜素等與初生代謝有關的化合物，如擬南芥中的和黃花蒿中的[20]；亞家族主要為一些特殊次生代謝物的合成提供異戊二烯骨架，起到防御草食系動物、吸引昆蟲授粉和抵御微生物等作用，如可防御草食性動物取食的番茄[21]和參與抗病反應的煙草[22]；亞家族通常存在于植物基因組中，目前研究較少，可能主要參與了植物激素如ABA（Abscisic acid和GA3（Gibberellic acid）的合成[6,23]。因此，推測屬于家族的基因較為保守，很可能作為看家基因在初生代謝產物的合成與積累過程中發揮重要作用，其在荊芥植物體內部的具體功能有待于進一步探究。另外，在觀察玉米、水稻、擬南芥等植物的亞家族聚類結果時，發現同種植物可能同時具有不同亞家族的基因。由此推測在荊芥中，除了在本研究中發現的屬于亞家族的基因外，極可能還具有與萜類等次生代謝產物生物合成相關的亞家族的基因序列。

通過使用大腸桿菌、酵母、煙草、擬南芥等模式生物來研究基因表達的技術已日趨成熟。密碼子偏好性的研究有助于人們更好地利用異源表達系統，克服異源表達的困難，選擇最合適的表達宿主。本研究發現荊芥基因偏好使用A或T結尾的密碼子，且編碼區A/T含量高于G/C含量。分析大腸桿菌、酵母、煙草、擬南芥與荊芥基因的密碼子使用偏好性，發現荊芥與煙草具偏好性差異較大的密碼子個數最少，說明該基因更適合在煙草中表達。

本研究為今后StDXS蛋白功能的鑒定及定向優化荊芥藥材品質提供了理論基礎，同時StDXS作為MEP途徑中的第1個限速酶，也為進一步探究荊芥萜類化合物生物合成的分子機制奠定基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cloning and bioinformatics analysis of 1-deoxy--xylulose 5-phosphate synthasegene from

LIN Gu-yin1, 2, ZHOU Pei-na1, YIN Meng-jiao1, 2, LIU Li-cheng1, 2, DAI Shi-lin1, 2, LIU Chan-chan1, 2, WU Qi-nan1, 2, 3

1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing 210023, China 3. National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Nanjing 210023, China

To clone 1-deoxy--xylulose 5-phosphate synthase () gene fromand perform the bioinformatics analysis.The full-length cDNA sequence ofgene was cloned by using RT-PCR based on transcriptome sequencing data ofgenerated in the previous study and further analyzed by bioinformatic methods.The clonedgene was 2 177 bp, containing a 2 157 bp open reading frame (ORF) which encoded 718 amino acids. The theoretical molecular weight was 77 240 and its isoelectric point was 6.32. StDXS protein might be located in the chloroplast, and it had no signal peptide and membrane spaning domain, it was non-secretory protein. Phylogenetic analysis indicated that sequence of amino acids was closely related to the evolution ofof the same family, and they both belonged tofamily. Codon bias analysis showed thatgene prefered to use A/T ending codon, with 28 skewed codons.was the most suitable host for exogenous expression ofgene.Thegene was cloned fromsuccessfully and its bioinformatics analysis was performed, which provided a theoretical basis for regulating the growth and development ofand improving the yield and quality of.

Briq.; 1-deoxy--xylulose 5-phosphate synthase; gene cloning; bioinformatics analysis; RT-PCR

R286.12

A

0253 - 2670(2021)02 - 0527 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.026

2020-03-06

國家自然科學基金面上項目（81973435）；國家自然科學基金面上項目（81473313）；國家自然科學基金青年科學基金項目（81903756）

林谷音（1996—），女，碩士研究生，研究方向為中藥學。E-mail: lgy_grace@sina.com

劉潺潺，女，講師，主要從事中藥資源生產與品質評價研究。E-mail: liuchanchan0317@outlook.com

吳啟南，男，教授，主要從事中藥資源生產與品質評價研究。Tel: (025)85811521 E-mail: qnwyjs@163.com

[責任編輯 時圣明]