基于高通量測序技術的黃芩提取物對熱證模型大鼠腸道菌群多樣性的影響

李自輝，陳平平，王 宇，張亞男，吳 娟，劉樹民*

基于高通量測序技術的黃芩提取物對熱證模型大鼠腸道菌群多樣性的影響

李自輝1, 2，陳平平1，王 宇1，張亞男1，吳 娟3，劉樹民1*

1. 黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 大連大學醫學院，遼寧 大連 116622 3. 黑龍江中醫藥大學 藥物安全性評價中心，黑龍江 哈爾濱 150040

探究黃芩提取物對熱證模型大鼠腸道菌群多樣性的影響，并探討中醫“熱者寒之”思想的科學內涵。雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、黃芩提取物（3 g/kg）組。除對照組外，其余各組大鼠于每日上午ig左甲狀腺素鈉混懸液（0.12 g/kg），造模1 h后，黃芩提取物組ig黃芩提取物（10 mL/kg），對照組與模型組ig等體積的飲用水，連續15 d。采用高通量測序技術對大鼠盲腸內容物的腸道菌群多樣性進行測序；取大鼠血清測定神經-內分泌-免疫系統中關鍵性指標，并構建差異菌屬與神經-內分泌-免疫系統的互作體系。黃芩提取物可顯著回調熱證模型大鼠神經-內分泌-免疫系統中關鍵性的12個指標，明顯改善腸道內分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）數量和α、β多樣性的失調，降低菌群生物豐度與多樣性指數，對熱證模型大鼠的6種差異菌門與25種差異菌屬的相對豐度起到調節作用。柯林斯菌屬、蒼白桿菌屬、普雷沃菌屬與神經-內分泌-免疫系統具有強相關作用。黃芩提取物可改善熱證模型大鼠神經-內分泌-免疫系統和腸道菌群多樣性的異常，柯林斯菌屬、蒼白桿菌屬、普雷沃菌屬可能是熱證模型大鼠腸道的潛在標志菌屬。

黃芩；熱證；腸道菌群；高通量測序；16S rRNA技術；神經-內分泌-免疫系統

熱證是中醫理論中的重要證型，病因多以陽氣亢盛、熱邪入血、陰氣不足為主，表現為口干、發熱、脈率加快等機體能量亢進的熱象[1-2]。中醫藥治療熱證常以“熱者寒之”為指導思想，研究發現神經-內分泌-免疫系統是調控其發生與發展的關鍵性靶標[3]，藥物通過不同途徑，以對神經-內分泌-免疫系統的影響為主要特征，可反映出中藥作用靶點與中醫證候靶點的關聯性，是中醫藥“辨證論治”的重要體現。腸道微生態與中醫證候存在密切關系[4]。張北華等[5]通過研究發現腸道菌群紊亂會導致脾虛泄瀉，加重脾虛證中濕困的病理表現；黃騰杰[6]發現腸道菌群結構失調與陽虛證密切相關，并找出羅斯氏菌屬等為陽虛證的特征菌屬。熱證狀態下，宿主腸道菌群多樣性的功能和結構與正常機體之間是否存在差異尚未見報道。

黃芩Georgi性寒，味苦，歸肺、膽、胃、大腸經，課題組前期研究將黃芩作為寒性模式中藥，已證明其對熱證模型大鼠物質與能量代謝及其相關生物酶具有顯著的抑制作用[7]，但其是否能對神經-內分泌-免疫系統產生影響尚不明確。本研究采用Illumina MiSeq平臺的16S rRNA高通量測序技術，探討黃芩提取物對熱證模型大鼠腸道菌群多樣性的變化和神經-內分泌-免疫系統的影響，對差異菌屬與神經-內分泌-免疫系統相關指標進行Pearson相關性分析，旨在從腸道微生態層面揭示黃芩干預熱證的作用機制，構建宿主-菌群-證候的相互作用關系，為完善中醫證候評價體系奠定理論基礎，并進一步詮釋“熱者寒之”的科學內涵。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠30只，6～8周齡，體質量（180±20）g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK（黑）2015-004，飼養于黑龍江中醫藥大學GLP實驗中心，室溫20～25 ℃，相對濕度為40%～60%，實驗動物給予標準飼料和自由飲水，并獲得黑龍江中醫藥大學倫理委員會批準（批準號DXLL2015061601）。

1.2 藥品與試劑

黃芩（批號20140623）購自河北承德藥材有限公司，經黑龍江中醫藥大學中藥資源教研室王振月教授鑒定為唇形科植物黃芩Georgi的干燥根；左甲狀腺素鈉片（批號H20160056，規格50 μg/片）購自德國默克-里昂制藥公司；大鼠去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）酶聯免疫試劑盒、大鼠5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶聯免疫試劑盒、大鼠多巴胺（dopamine，DA）酶聯免疫試劑盒、大鼠促甲狀腺激素（thyrotropin，TSH）酶聯免疫試劑盒、大鼠促甲狀腺激素釋放激素（thyrotropin-releasing hormone，TRH）酶聯免疫試劑盒、大鼠促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）酶聯免疫試劑盒、大鼠促腎上腺皮質激素釋放激素（corticotropin-releasing-hormone，CRH）酶聯免疫試劑盒、大鼠17-羥皮質類固醇（17-hydroxycorticosteroids，17-OHCS）酶聯免疫試劑盒、大鼠白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）酶聯免疫試劑盒、大鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶聯免疫試劑盒、大鼠白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）酶聯免疫試劑盒、大鼠γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）酶聯免疫試劑盒，批號均為20160816，購自南京建成生物工程研究所；大鼠飼料購自北京科澳協力飼料有限公司。

1.3 儀器

FLx800型多功能酶標儀（美國BioTek公司）；RS232G型紫外分光光度計（德國Eppendorf公司）；AUT0520型凝膠成像系統、32RL117950型綜合式紫外分析儀（美國BG公司）；Pico17型離心機（美國Thermo公司）；QuantiFluor TBS380型熒光計（美國Promega公司）。

2 方法

2.1 黃芩提取物的制備

黃芩飲片浸泡30 min，分別加入10倍量和8倍量的蒸餾水提取，合并2次提取液，冷凝回流2 h，減壓回收提取液，真空凍干制成干燥粉末（經HPLC測得黃芩苷質量分數為12.87%，黃芩素質量分數為0.51%，漢黃芩苷質量分數為3.36%，漢黃芩素質量分數為0.28%），存放于干燥器內備用。

2.2 動物分組、造模與給藥

大鼠適應性飼養3 d后，按照體質量均衡分配原則，隨機分為對照組、模型組、黃芩提取物（3g/kg）組，每組10只[8]。左甲狀腺素鈉片研磨至粉末，溶于飲用水配制成質量濃度為0.04 g/mL的溶液；黃芩提取物凍干粉溶于飲用水配制成質量濃度為1 g/mL的混懸液。每天9: 00時對照組ig飲用水（10 mL/kg），其余各組大鼠ig左甲狀腺素鈉混懸液（0.12 g/kg）[9]；自造模開始，每天10: 00時黃芩提取物組ig黃芩提取物（10 mL/kg），對照組、模型組ig等體積飲用水，連續15 d。

2.3 體征指標檢測

每天給藥前記錄大鼠飲水量和體質量的變化，于給藥第0、5、10、15天檢測并記錄大鼠肛溫。

2.4 樣本收集與處理

末次給藥24 h后，大鼠ip 20%烏拉坦麻醉，腹主動脈取血，常溫靜置30 min，4 ℃、3500 r/min離心10 min，取上清液，于?80 ℃冰箱保存備用。

每組隨機選取5只大鼠，脫頸椎處死后取盲腸部位內容物于無菌離心管中，迅速凍存于液氮中，立即轉存于?80 ℃冰箱，用于腸道菌群多樣性的分析。

2.5 腸道菌群多樣性分析

采用Illumina MiSeq測序平臺，選用16S rRNA V4可變區的通用引物進行擴增，引物序列長度為280 bp，前引物為5’-AYTGGGYDTAAAGNG-3’，后引物為5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’，98 ℃預變性30 s，變性15 s，50 ℃退火30 s，循環25次，72 ℃延伸30 s，72 ℃最終延伸5 min，4 ℃終止保存。擴增結果用凝膠回收試劑盒回收片段。在Illumina MiSeq平臺應用文庫檢測和定量試劑盒對PCR產物進行定量分析，制備試劑盒與高靈敏度DNA檢測試劑盒進行建庫，MiSeq試劑盒循環2×300 bp進行雙端測序。采用QIIME軟件、R軟件、Mothur軟件對測序結果進行可視化分析。

2.6 血清指標檢測

按照酶聯免疫試劑盒說明書分別檢測大鼠血清中NE、5-HT、DA、TSH、TRH、ACTH、CRH、17-OHCS、IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ水平。

2.7 數據處理

3 結果

3.1 黃芩提取物對熱證模型大鼠體征指標的影響

如圖1所示，第15天，與對照組比較，模型組大鼠肛溫升高，飲水量和體質量顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，黃芩提取物組大鼠肛溫降低，飲水量和體質量顯著降低（＜0.01），表明黃芩提取物能夠明顯改善熱證模型大鼠一般體征的變化。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

3.2 黃芩提取物對熱證模型大鼠血清指標的影響

如表1～3所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中NE、DA、TSH、TRH、CRH、ACTH、17-OHCS、IL-2、IFN-γ水平顯著升高（＜0.05、0.01），5-HT、IL-6、IL-10水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，黃芩提取物組大鼠NE、DA、TSH、TRH、CRH、ACTH、17-OHCS、IL-2、IFN-γ水平顯著降低（＜0.05、0.01），5-HT、IL-6、IL-10水平顯著升高（＜0.01）。

3.3 腸道菌群分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）與多樣性分析

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠腸道菌群門、綱、目、科、屬、種6類OTUs地位豐度明顯增加；與模型組比較，黃芩提取物組大鼠腸道菌群門、綱、目、科、屬、種6類OTUs地位豐度在一定程度上均有所減少。如圖3所示，隨著樣本數量增加，腸道菌群數量會趨于某一恒定值，表明測序深度充分，Specaccum物種累積曲線能足夠反映群落豐度水平。α多樣性分析結果如表4所示，與對照組比較，模型組大鼠腸道菌群豐度指數（Chao1、ACE）與多樣性指數（Simpson、Shannon）顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，黃芩提取物組大鼠腸道菌群豐度指數與多樣性指數顯著降低（＜0.01）。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）考察大鼠腸道菌群β多樣性的差異，如圖4所示，模型組與對照組大鼠腸道菌群明顯分開，表明2組菌群結構具有顯著性差異；黃芩提取物組大鼠腸道菌群趨向對照組，表明黃芩提取物組腸道菌群結構與對照組相近，兩者可能存在一定的親緣關系。

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

圖3 大鼠腸道菌群的Specaccum物種累積曲線

3.4 腸道菌群組成與結構分析

如圖5所示，在門水平，與對照組比較，模型組大鼠腸道菌群具有顯著性差異的菌門有6個（＜0.05、0.01），擬桿菌門（Bacteroidetes）、螺旋菌門（Spirochaetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）上調，厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）下調；黃芩提取物組可顯著性回調這6個菌門（＜0.05、0.01）。如圖6、7所示，在屬水平，通過對差異菌門中排前50的優勢菌屬進行聚類分析，將具有共同差異性菌屬的位置在系統發育樹中標注，分別是奇異菌屬、球桿菌屬、布勞特氏菌屬、擬桿菌屬、克里斯滕森菌屬、梭菌屬、柯林斯菌屬、棒狀桿菌屬、糞芽孢菌屬、糞球菌屬、多爾氏菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、氣球菌屬、顫螺旋菌屬、蒼白桿菌屬、狄氏副擬桿菌屬、考拉桿菌屬、帕拉普氏菌屬、普雷沃菌屬、羅斯氏菌屬、瘤胃球菌屬、薩特氏菌屬、葡萄球菌屬、密螺旋體菌屬。如圖8所示，與對照組比較，模型組大鼠腸道菌群具有顯著性差異的菌屬有25個（＜0.05、0.01），其中17種菌屬上調，8個菌屬下調。與模型組比較，黃芩提取物組可顯著性回調這25個菌屬（＜0.05、0.01）。

3.5 差異腸道菌群關聯性分析

應用Pearson相關系數分析法，探究黃芩提取物干預熱證模型大鼠血清相關指標的過程中差異腸道菌群與神經-內分泌-免疫系統的聯系，當||＞0.5且＜0.05，表示兩者之間存在顯著相關性；當||＞0.8，表示兩者之間具有強相關性。如圖9、10所示，神經系統與普雷沃菌屬、柯林斯菌屬、多爾氏菌屬關聯性較強；免疫系統與普雷沃菌屬、柯林斯菌屬、螺桿菌屬、薩特氏菌屬、葡萄球菌屬、克里斯滕森菌屬、蒼白桿菌屬關聯性較強；內分泌系統與瘤胃球菌屬、柯林斯菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬、球桿菌屬、葡萄球菌屬、蒼白桿菌屬關聯性較強。表明黃芩提取物不僅能改善腸道菌群多樣性，同時也能回調神經-內分泌-免疫系統的關鍵指標。

圖6 各組大鼠菌群優勢菌屬的群落分類豐度分布熱分析

圖9 差異菌群與血清指標相關性的熱分析

黃色代表血清指標；綠色代表腸道差異菌屬；灰色線代表從屬關系；紅色線代表正相關；藍色線代表負相關

4 討論

熱證在中醫臨床中是一個復雜而綜合的統稱，中醫辨證一般將其分為實熱證與虛熱證，與相應的病變部位或病因相結合產生規范的評價與量化的診斷標準[1]。左甲狀腺素鈉，又稱為優甲樂，臨床常用于治療由各種原因引起的甲狀腺功能減退，可促進機體各組織與器官氧化反應[10]，飲水量、體質量、體溫變化是其一般體征的直觀表現[11]。DA、5-HT、NE是中樞神經系統中重要的神經遞質，可調控交感神經系統與脊髓神經系統的功能，是大腦內部興奮活動的重要體現[12]；CRH、ACTH、17-OHCS是參與下丘腦與垂體的關鍵性腎上腺皮質激素，與TRH、TSH共同作用于內分泌系統中下丘腦-垂體-促甲狀腺素軸的調節，是中醫熱證形成物質與能量代謝亢進的表現[13]。中醫熱證免疫系統會加速消耗免疫系統，T淋巴細胞的轉化率增加，造成CD4＋T細胞中的IL-2、IFN-γ與CD8＋T中的IL-6、IL-10水平失調，導致炎癥因子水平升高、抗炎因子水平降低[14-15]。結合飲食量、肛溫與體質量相關數據分析，本研究結果顯示熱證狀態下機體的各個系統均處于興奮水平，黃芩提取物對熱證模型大鼠神經-內分泌-免疫系統中的關鍵指標均起到調節作用，表明黃芩提取物能從整體出發改善神經-內分泌-免疫系統和相應體征，是中醫“熱者寒之”的價值體現。

腸道微生態系統在人體中處于動態平衡，當受到外界的干預或刺激后，菌群穩態被打破，在不斷變化中恢復原先相關腸道菌群的組成與結構的功能，通過對菌群微生態相關指標的評價，能反映出藥物對疾病治療的效果[16-17]。本研究發現黃芩提取物可顯著回調具有差異的6個菌門與25個菌屬。擬桿菌門與厚壁菌門之和占人體細菌總數量的90%以上，Gulas等[18]通過對厚壁菌門與擬桿菌門相對比例的研究發現，腸道內容物中擬桿菌門與厚壁菌門的比例大于正常值時，將加速腸內微生物對食物中熱量的有效吸收，促進機體能量代謝與物質代謝的速率；放線菌門（主要以雙歧桿菌為主）和變形菌門（主要以腸桿菌為主）屬于中性菌屬，若腸道內微環境遭到破壞，會變成帶有侵襲性或致病性菌群遷移到身體其他部位，造成相關組織或系統的病變[19]。本研究結果顯示黃芩提取物可改善熱證大鼠模型中擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門與變形菌門的數量，促進紊亂的腸道微環境恢復正常的動態平衡與穩態，本研究將腸道微生態作為整體，體現出中藥黃芩對熱證治療的“整體觀”思想。螺旋菌門與梭桿菌門為宿主內的微量菌門，隨著生物領域技術的不斷發展，其相應的菌物學意義有待于進一步探索。

聯合差異菌屬與神經-內分泌-免疫系統關鍵指標的分析結果發現，柯林斯菌屬對免疫系統、中樞神經系統與內分泌系統均有強相關作用?？铝炙咕鷮偈且环N產氣菌屬，可促進β-類固醇脫氫酶的產生，加快體內熊去氧膽酸的合成，提高機體物質與能量代謝的轉化效率，增強機體抗氧化能力及免疫功能[20-21]；普雷沃菌屬為擬桿菌門不產芽孢的厭氧菌屬，主要代謝產物為乙酸、琥珀酸和少量丁酸[22]，能促進神經鞘脂類遞質的產生，影響免疫系統和神經系統的反饋調節[23-24]；蒼白桿菌屬是一種條件致病菌屬，對免疫功能低下者具有強感染能力，可造成自身免疫應答反應過激、內分泌系統代謝紊亂等現象[25-26]。本研究結果表明，黃芩提取物對25種差異菌屬和神經-內分泌-免疫系統軸的關鍵指標具有顯著回調能力，表明中藥具有多靶點、多途徑的特點，更體現出中醫藥治療“整體觀”的思維。

綜上所述，黃芩提取物可有效改善熱證大鼠模型腸道菌群多樣性和神經-內分泌-免疫系統的變化，通過16S rRNA高通量測序技術可建立對中醫證候評價體系，對相關中藥及復方用于此類中醫證候研究具有深遠的指導意義。腸道微生態變化不僅會對機體腸道菌群多樣性產生影響，還會對相關組織細胞中蛋白質合成或轉錄因子引起反饋效應，課題組后續將聯合多組學技術和整合藥理學方法，對“熱者寒之”的科學內涵進行更深入的詮釋。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect ofextract on intestinal microflora diversity in rats with heat syndrome based on high-throughput sequencing

LI Zi-hui1, 2, CHEN Ping-ping1, WANG Yu1, ZHANG Ya-nan1,WU Juan3, LIU Shu-min1

1. Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China 2. Medical College, Dalian University, Dalian 116622, China 3. Center of Drug Safety Evaluation, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

To explore the effect ofextract on the diversity of intestinal flora in heat syndrome model rats, and explore the scientific connotation of the thought of “treating heat syndrome with cold natured drugs” in traditional Chinese medicine.Male SD rats were randomly divided into control group, model group andextract (3 g/kg) group. Except for the control group, rats in the other group were ig levothyroxine sodium suspension (0.12 g/kg) every morning, one hour after modeling, rats inextract group were igextract (10 mL/kg), rats in control group and model group were ig same volume of drinking water for 15 d. 16 S rRNA technique was used to sequence the intestinal microflora in the V4 area of the cecum, and the rat serum was taken to determine 12 key indexes in the neuro-endocrine-immune system. The interaction system between differential bacteria and neuro-endocrine-immune system was constructed.extract significantly adjusted 12 key indexes in the neuro-endocrine-immune system of heat syndrome model rats, significantly improved the number of operational taxonomic units (OTUs) and the imbalance of diversity between α, β in the intestinal tract, reduced the biological richness and diversity index of flora, and regulated the relative abundance of six different bacteria and 25 different bacteria in heat model rats.,andhad strong correlation with neuro-endocrine-immune system.extract could improve the abnormality of neuro-endocrine-immune system and intestinal flora in heat syndrome model rats.,andmay be potential markers of heat syndrome model.

Georgi;heat syndrome; intestinal flora; high-throughput sequencing; 16S rRNA technique; neuro- endocrine-immune system

R285.5

A

0253 - 2670(2021)02 - 0422 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.015

2020-07-01

國家重點基礎研究發展“973”計劃項目（2013CB531804）；黑龍江省自然科學基金聯合引導項目（LH2020H099）

李自輝，男，博士，講師，研究方向為中藥性味理論及藥效物質基礎研究。Tel: 15604616931 E-mail: 1831794073@qq.com

劉樹民，男，博士，教授，博士生導師，研究方向為中藥性味理論及藥效物質基礎研究。Tel: 13945133028 E-mail: keji-liu@163.com

[責任編輯 李亞楠]