基于網絡藥理學的刺五加總苷抗疲勞作用機制研究

高 寒，徐 偉*，張宇航，邱智東，傅超美，綦曉娜，賈艾玲, *

? 藥理與臨床 ?

基于網絡藥理學的刺五加總苷抗疲勞作用機制研究

高 寒1，徐 偉1*，張宇航1，邱智東1，傅超美2，綦曉娜3，賈艾玲1, 2*

1. 長春中醫藥大學藥學院 中藥有效成分省部共建教育部重點實驗室，吉林 長春 130117 2. 成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137 3. 北華大學附屬醫院 婦產科，吉林 吉林 132000

基于網絡藥理學方法探究刺五加總苷抗疲勞的潛在作用機制。以刺五加總苷中7種主要活性成分為研究對象，利用Swiss Target Prediction網絡平臺預測其作用靶點；通過GeneCards、OMIM、DiGseE數據庫獲取與疲勞有關的靶標，借助Cytoscape 3.7.2軟件構建“活性成分-抗疲勞靶點”網絡圖，并通過度值篩選核心成分；使用String平臺進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，結合Cytoscape 3.7.2軟件構建PPI網絡圖，通過度值、節點緊密度、節點介度篩選關鍵靶點，并利用DisGeNET數據庫對靶點的類型進行歸屬；使用AutoDock vina軟件對核心成分與關鍵靶點進行分子對接；采用DAVID數據庫對刺五加總苷抗疲勞的作用靶點進行基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。獲得刺五加總苷中7種主要活性成分包括刺五加苷A、刺五加苷B、刺五加苷B1、刺五加苷C、刺五加苷D、刺五加苷E和芝麻素，預測得到抗疲勞靶點83個，篩選出核心成分3個，包括刺五加苷B、刺五加苷B1、刺五加苷C，關鍵靶點4個，包括熱休克蛋白90α家族A級成員1（heat shock protein 90 α family class A member 1，HSP90AA1）、信號傳導及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）；分子對接結果顯示，核心成分與關鍵靶點的結合能力與三磷酸腺苷二鈉（ATP-2Na）相近；基因富集分析得到GO功能條目250個（＜0.05），通路36條（＜0.05）；網絡藥理學分析顯示，刺五加總苷主要通過藥物反應、細胞增殖的正調控、缺氧反應等生物過程，以及調節缺氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、胰島素信號通路和物質代謝等發揮抗疲勞作用。初步探究了刺五加總苷抗疲勞作用的潛在靶點和相關通路，為刺五加抗疲勞作用機制的研究提供科學依據和參考。

刺五加總苷；抗疲勞；網絡藥理學；刺五加苷B；刺五加苷B1；刺五加苷C

疲勞最早記載于《金匱要略》，是一種常見而復雜的疾病狀態，隨著現代生活節奏加快，由疲勞引發的慢性疲勞綜合征發病率逐年上升，給社會造成了很大負擔[1]。世界衛生組織提出，疲勞已成為現今社會危害人類身心健康的主要因素之一，但其發病機制尚未完全闡明[2]。研究表明，疲勞的產生可能與免疫系統異常、線粒體/能量代謝異常、心血管系統異常等過程有關[3-5]。

刺五加為五加科植物刺五加(Rupr. et Maxim.) Harms的干燥根和根莖或莖[6]。刺五加的應用歷史悠久，歷代本草著作中均有所記載。南朝陶弘景曾在《名醫別錄》中指出，刺五加以“五葉者良”，具有“補中、益精、堅筋骨、強志意”的功效。明代李時珍在《本草綱目》中記載“寧得五加一把，不要金玉滿車”，稱刺五加“久服輕身耐老”，被列為上品；刺五加性溫，味辛、微苦，歸脾、腎、心經，主治脾腎陽虛、腰膝酸痛、體虛乏力、食欲不振、失眠多夢等癥[7]。現代藥理學研究表明，刺五加在免疫調節、抗疲勞、抗腫瘤、抗衰老、抗應激等方面均有良好表現[8-11]。其中抗疲勞作用尤為顯著，刺五加總苷是刺五加抗疲勞的主要活性成分，其作用較刺五加根提取物強40～120倍，且強于人參提取物和人參皂苷[12]，但刺五加總苷發揮抗疲勞作用的分子機制尚不明確。網絡藥理學融合系統生物學、多向藥理學等學科，借助計算機分析技術，通過“疾病-表型-基因-藥物”多層次網絡的構建，從整體角度探索藥物與疾病間的關聯，進而多層次地闡明藥物的作用機制，體現了中醫辨證的特點和中藥治療的整體觀，近年來已經成為中藥研究的一種有效技術手段[13-18]。本研究旨在通過網絡藥理學方法，基于“藥物-靶點-通路”多層次網絡模式，預測刺五加總苷抗疲勞作用的相關靶點及作用機制，并利用分子對接技術對預測的結果進行佐證，為刺五加的臨床應用提供一定的理論依據。

1 方法

1.1 刺五加總苷活性成分的篩選

刺五加根莖的主要活性成分為酚苷類化合物，通過文獻檢索選取刺五加總苷中含量較高的苷類成分，使用PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/）檢索得到各成分簡化分子線性輸入規范（simplified molecular-input line-entry system，SMILES）。

1.2 刺五加總苷活性成分作用靶點的預測

Swiss Target Prediction（http://www.swisstarget- prediction.ch/）是一種基于已知配體的2D、3D相似性度量的組合來預測小分子靶點的網絡平臺[19]。輸入SMILES式，并將屬性設置為“homo sapiens”，獲得所選成分潛在靶點的預測結果。

1.3 抗疲勞靶點篩選

在GeneCards數據庫（http://www.genecards. org/）、OMIM數據庫（http://www.omim.org）、DiGseE（http://210.107.182.61/geneSearch/）數據庫中搜索“fatigue”“anti-fatigue”，獲得與疲勞相關的基因，合并3個數據庫的查找結果并刪除重復靶點，所得靶點即為抗疲勞作用的相關靶點。

1.4 “活性成分-抗疲勞作用靶點”網絡構建

將刺五加活性成分作用靶點和抗疲勞靶點的篩選結果導入Cytoscape 3.7.2軟件，進行可視化處理，構建“刺五加總苷活性成分-抗疲勞作用靶點”網絡。網絡圖中，關鍵化合物和靶點用節點表示，節點之間相互作用的關系用邊表示。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建

String（https://string-db.org/）是用來分析蛋白質之間相互作用的數據庫，可進一步研究刺五加總苷抗疲勞的作用機制[20]。將得到的抗疲勞靶點上傳至String數據庫，限定研究物種為“homo sapiens”，將最低相互作用評分設置為最高等置信度（highest confidence）＝0.900，隱藏沒有相互聯系的節點，獲得蛋白互作關系，導出數據文件，保留文件中節點1、節點2、連接評分數據，并導入到Cytoscape 3.7.2軟件中，設置參數使節點大小和顏色深淺反映度值大小，邊的粗細反映結合率評分高低，建立PPI網絡圖。

1.6 作用靶點類型歸屬

DisGeNET數據庫（http://www.disgenet.org/web/ DisGeNET/menu）是包含與人類疾病相關的基因和變體的平臺之一。在DisGeNET數據庫中選用基因檢索的方式，將刺五加活性成分的作用靶點依次導入到數據庫中，獲得靶點類型信息。

1.7 分子對接驗證

將核心成分與關鍵靶點進行分子對接，并用臨床治療藥物三磷酸腺苷二鈉（ATP-2Na）進行對照分析[21]。首先通過PubChem數據庫獲得化合物的3D結構，并利用Open Babel 2.3.2軟件將獲得的SDF文件轉化為PDB格式。從PDB數據庫（http://www.rcsb.org/pdb）獲得關鍵靶點的3D結構PDB格式，運用PyMOL 2.3.4軟件對蛋白質進行去水、去配體等操作，使用AutoDock 4.2.6軟件對關鍵靶點進行加氫和計算電荷處理，將化合物和靶蛋白格式轉換為pdbqt格式，利用AutoDock Vina 1.1.2軟件進行對接，對結果進行分析處理。

1.8 生物過程與通路分析

生物學信息注釋數據庫（DAVID，https://david. ncifcrf.gov/summary.jsp）作為最權威的數據庫，可提供系統綜合的生物功能注釋信息。將刺五加總苷的抗疲勞靶點導入DAVID數據庫，標識符設置為“official gene symbol”，列表類型設置為“gene list”，限定物種為“homo sapiens”。對潛在靶點進行基因本體（gene ontology，GO）分析，以研究刺五加總苷抗疲勞的主要生物功能；進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，以研究刺五加總苷抗疲勞的主要信號通路。設定＜0.05，并按照值由小到大進行排序，選取前15條生物過程或通路，進行可視化處理。

2 結果

2.1 刺五加總苷抗疲勞活性成分的篩選

通過文獻檢索選取刺五加總苷中含量較高的苷類成分[22]，分別為刺五加苷A（eleutheroside A）、刺五加苷B（eleutheroside B）、刺五加苷B1（eleutheroside B1）、刺五加苷C（eleutheroside C）、刺五加苷D（eleutheroside D）、刺五加苷E（eleutheroside E）、芝麻素（sesamin），為刺五加根莖總苷的主要活性成分。因此，本研究選擇以上7種苷類成分進行網絡藥理學分析。

2.2 “活性成分-抗疲勞作用靶點”網絡構建

Swiss Target Prediction數據庫預測7種活性成分作用靶點共154個，由GeneCards、OMIN、DiGseE數據庫篩選得到疲勞/抗疲勞靶點4955個，取交集得到刺五加總苷抗疲勞靶點83個。借助Cytoscape 3.7.2軟件構建“活性成分-抗疲勞靶點”網絡圖，見圖1。該網絡中共有90個節點（化合物7個、靶點83個），115條相互作用的邊，內圈代表刺五加總苷的活性成分，外圈代表這些活性成分對應的抗疲勞靶點，邊代表兩者的相互作用。度值較高的化合物刺五加苷B、刺五加苷B1、刺五加苷C可能是刺五加總苷抗疲勞的核心成分。

2.3 PPI網絡分析

如圖2所示，圖中節點表示靶蛋白，邊表示蛋白之間的關聯，網絡圖中共涉及60個節點、120條邊。節點越大，度值越大；邊越粗表明連接評分越高。PPI網絡中度值的平均值為4，節點緊密度的平均值為0.33，節點介度的平均值為0.07。經篩選，度值、節點緊密度、節點介度均大于平均值的靶點有4個，分別為熱休克蛋白90α家族A級成員1（heat shock protein 90 α family class A member 1，HSP90AA1）、信號傳導及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9），提示它們可能是刺五加活性成分發揮抗疲勞作用的關鍵靶點。將以上關鍵靶點依次導入DisGeNET數據庫，獲取靶點對應的類型，基本信息見表1。結果表明，刺五加抗疲勞過程中有蛋白、轉錄因子、酶等物質的參與。

圖1 刺五加總苷“活性成分-抗疲勞靶點”網絡圖

圖2 刺五加總苷抗疲勞靶點的PPI網絡分析

2.4 分子對接驗證

核心成分、ATP-2Na與關鍵靶點的分子對接結果見表2。一般認為結合能小于0，化合物與蛋白可自發結合，結合能越低，發生作用的可能性越大。分子對接結果顯示，網絡藥理學所預測的核心成分與關鍵靶點均可自發結合，且與ATP-2Na結合能力相近，證實了網絡藥理學預測結果的可靠性。其中，核心成分刺五加苷B、刺五加苷B1與關鍵靶點結合能均≤?20.9 kJ/mol，與蛋白HSP90AA1的結合能力強于ATP-2Na，表明這兩個化合物與關鍵靶點結合活性更好[23]，其與關鍵蛋白之間的相互作用見圖3。

表1 刺五加總苷抗疲勞關鍵靶點的基本信息

2.5 GO功能富集分析

GO分析分為生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cellular component，CC）3個部分，共同描述基因產物的功能。借助DAVID數據庫對刺五加總苷發揮抗疲勞作用的83個潛在靶點進行GO富集分析，設定＜0.05，共獲得250條生物過程或通路，其中175個與BP相關、51個與MF相關、24個與CC相關。根據值從小到大排序，選取前15條GO條目，利用Omicshare數據庫（http://www. omicshare.com/）繪制高級氣泡圖，如圖4～6所示。氣泡表示富集在該條GO條目上的基因個數，氣泡越大，表示富集在該條GO條目上的基因個數越多。如圖4所示，靶點主要涉及藥物反應（response to drug）、細胞增殖的正調控（positive regulation of cell proliferation）、MAP激酶活性的正調控（positive regulation of MAP kinase activity）、缺氧反應（response to hypoxia）等生物過程。體內短暫缺氧，糖酵解過程增強，產生大量乳酸、尿素等代謝產物，從而產生疲勞[24]。刺五加總苷抗疲勞的作用機制可能是通過增強機體運動時的攝氧能力，從而改變機體供能方式，延緩運動性疲勞的產生。如圖5所示，靶點主要集中于藥物結合（drug binding）、多巴胺結合（dopamine binding）、金屬內肽酶活性（metalloendopeptidase activity）、神經遞質受體活性（neurotransmitter receptor activity）等分子功能。多巴胺（dopamine，DA）是中樞神經系統的重要神經遞質之一，可通過調節情緒從而緩解疲勞。徐明等[25]研究表明，在運動過程中保持DA的合成與代謝，可延遲疲勞發生。如圖6所示，靶點主要涉及質膜（plasma membrane）、胞液（cytosol）、蛋白質細胞外基質（proteinaceous extracellular matrix）等細胞組分。關鍵靶點HSP90AA1可在胞液中維持蛋白質穩態并實現細胞保護功能[26]。

2.6 KEGG通路富集分析

KEGG分析共獲得36條通路（＜0.05），按照值從小到大篩選出前15條通路，利用GraphPad Prism 7繪圖，如圖7所示。主要通路有鈣信號通路（calcium signaling pathway）、缺氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號通路（HIF-1 signaling pathway）、胰島素信號通路（insulin signaling pathway）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等，涉及淀粉、蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）和氮代謝（nitrogen metabolism）等，涉及神經活性配體-受體相互作用和鈣離子信號傳導途徑，具體信息見表3。HIF-1信號通路與無氧運動引起的細胞缺氧應激有關，可導致乳酸等代謝物質堆積，產生疲勞感[27]；胰島素信號通路與疲勞關系密切，運動中胰島β細胞分泌胰島素減少，肌肉群收縮，胰島素攝取量增多，胰島素可促進運動過程中的脂質代謝，抑制肝臟糖異生，從而促進運動中的能量供應[28]。

圖6 CC富集分析

3 討論

《本草綱目》中記載刺五加“久服輕身耐老”，與現代藥理學研究中刺五加的抗疲勞作用密切相關，網絡藥理學體現了中醫辨證的特點和中藥治療的整體觀，有助于多層次地闡明藥物的作用機制。本研究基于網絡藥理學方法，借助相關數據庫和軟件對刺五加總苷抗疲勞的核心成分與作用機制進行了科學探討。

“活性成分-作用靶點”網絡表明刺五加總苷抗疲勞具有多成分、多靶點的特點，PPI網絡表明刺五加總苷的靶蛋白之間相互關聯，共同發揮作用。7種苷類成分均具有抗疲勞作用，其中刺五加苷B、刺五加苷B1、刺五加苷C的度值較高，可能是刺五加總苷發揮抗疲勞作用的核心成分。HSP90AA1、STAT3、VEGFA、MMP9為刺五加總苷抗疲勞的關鍵靶點，分子對接結果顯示，核心成分與關鍵靶點均可自發結合，且與臨床藥物ATP-2Na結合能力相近，與網絡藥理學的預測結果一致。刺五加苷B、刺五加苷B1與關鍵靶點結合活性更高，與蛋白HSP90AA1的結合能力強于ATP-2Na。研究表明，刺五加苷B可明顯減輕高強度運動對大鼠肝臟、心肌等的損傷，有利于減少含氮化合物的分解代謝供能，可延緩機體運動性疲勞的發生并促進疲勞的消除[29]。骨骼肌細胞中的酶、激素和其他相關因子的變化對疲勞的產生和恢復有重要的影響，刺五加苷B可促進骨骼生成，其分子機制可能與核轉錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）、PI3K/Akt信號通路有關[30-31]。有關刺五加苷B1、刺五加苷C的抗疲勞作用報道較少，本研究可為2個化合物的抗疲勞作用研究提供科學依據。

長時間的運動會產生大量的超氧陰離子自由基，破壞肌細胞膜的脂質雙分子層，導致膜上一些重要的蛋白質失活，從而影響肌細胞膜的正常功能[32]。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一類高度保守的蛋白質，參與多種生物過程，HSP90AA1作為家族的重要成員，可通過其C末端結構域嵌入脂質雙層中，在應激條件下對膜穩定具有重要作用[33]。白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）是由輔助T細胞2（T helper 2，Th2）、CD4＋T等多種適應性免疫細胞分泌的一種多效價細胞因子，可促進運動性疲勞的恢復，其表達受STAT3調控[34-35]。VEGFA是血小板衍生生長因子家族的成員，可增強血管通透性，缺血/缺氧條件下通過誘導VEGFA表達可促進血管生成，對組織含氧量的恢復和器官功能的修復具有重要意義[36]。Ca2+過量蓄積可抑制線粒體呼吸，使三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成下降，導致肌肉疲勞[32]。金屬蛋白酶是可降解細胞外基質的具有鈣、鋅依賴性的內源性蛋白酶家族，MMP9是家族中重要一員，其結構中存在與結構功能相關的鈣離子和鋅離子結合位點，其表達可能與疲勞有關。

GO功能分析結果表明，刺五加總苷抗疲勞廣泛涉及細胞過程，物質、能量代謝過程，對應激的應答等多種生物學過程，且包括神經遞質、金屬離子、蛋白等多種物質的參與，表明了疲勞發生機制的復雜性。KEGG富集分析表明，刺五加總苷抗疲勞過程中主要通路有HIF-1、Ca2＋、PI3K-Akt、癌癥、胰島素信號通路，且與氮代謝、淀粉和蔗糖代謝等物質代謝過程有關。HIF-1是細胞在缺氧條件下產生的蛋白性調節因子，運動會導致機體組織細胞的運動性缺氧，骨骼肌中HIF-1α蛋白和基因表達顯著上升[37]。運動產生過量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），誘導機體氧化應激，引起肌肉疲勞，PI3K-Akt通路可調節糖代謝和脂肪代謝，調節細胞凋亡，是機體抵抗氧化應激的重要通路[38]。抑制PI3K/Akt通路會使HIF-1活性降低，表明PI3K/Akt通路可能參與HIF-1活化[39]。運動時離子代謝的紊亂，也會導致疲勞的產生。研究表明，大鼠急性運動后線粒體Ca2＋含量增加，ATP水平下降，導致膜脂質過氧化反應加強，促進疲勞的發生，提示鈣離子通路的調節對機體抗疲勞具有重要意義。刺五加總苷主要通過作用于細胞凋亡、炎癥反應、氧化應激等過程共同發揮抗疲勞作用。

綜上所述，刺五加總苷抗疲勞的作用是通過多成分、多靶點、多通路的協同作用來實現的。本研究預測的潛在活性成分、靶點、生物功能和通路與文獻報道基本符合，分子對接結果驗證了預測的核心成分和關鍵靶點具有較好的結合活性，表明本研究的預測較為準確可靠，可從分子層面為闡釋刺五加“久服輕身耐老”的抗疲勞作用機制提供一定理論基礎和參考依據，課題組后續將進一步對相關靶點和通路進行驗證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Anti-fatigue mechanism ofglycosides based on network pharmacology

GAO Han1, XU Wei1, ZHANG Yu-hang1, QIU Zhi-dong1, FU Chao-mei2, QI Xiao-na3, JIA Ai-ling1, 2

1. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Active Ingredient of Ministry of Education, School of Pharmaceutical Sciences, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China 2. School of Pharmaceutical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 3. Department of Obstetrics and Gynecology, Affiliated Hospital of Beihua University, Jilin 132000, China

To explore the anti-fatigue mechanism ofglycosides based on network pharmacology.Seven main components inglycosides were used as research objects. Swiss Target Prediction was used to predict the potential targets of these components. The related targets of anti-fatigue were provided by GeneCards, OMIM, DiGseE databases, and Cytoscape 3.7.2 software was used to construct the active ingredients-anti-fatigue target network. Core components were selected by degree value. The protein interaction network (PPI) was constructed by String platform and Cytoscape 3.7.2. Key targets were selected by degree value, closeness, and betweenness, and the type of targets were attributed by DisGeNET database. AutoDock vina software was used to dock the molecules of the core components with the key targets. The geneontology (GO) andKyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathways involved in the targets were analyzed by DAVID database.A total of seven active components including eleutheroside A, eleutheroside B, eleutheroside B1, eleutheroside C, eleutheroside D, eleutheroside E, sesamin and 83 targets ofglycosides were involved, three core components including eleutheroside B, eleutheroside B1 and eleutheroside C, four key targets including heat shock protein 90 α family class A member 1 (HSP90AA1), signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), vascular endothelial growth factor A (VEGFA), and matrix metalloproteinase 9 (MMP9) were screened. Molecular docking showed that the binding ability of the core components to the key targets was close to that of ATP-2Na. After gene enrichment analysis, 250 GO terms (< 0.05) and 36 KEGG pathways (< 0.05) were obtained. The results showed that the process of response to drug, positive regulation of cell proliferation, response to hypoxia were mainly involved by adjusting the HIF-1, PI3K-Akt, insulin signaling pathway and material metabolism to exert its anti-fatigue effect.Main targets and related pathways of anti-fatigue effects ofglycosides were preliminarily investigated, which provided scientific basis and reference for study of anti-fatigue mechanism of.

glycosides; anti-fatigue; network pharmacology; eleutheroside B; eleutheroside B1; eleutheroside C

R285.5

A

0253 - 2670(2021)02 - 0413 -09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.014

2020-07-22

國家自然科學基金資助項目（81973712）；吉林省發改委項目（2020C007）；吉林省科技廳項目（20200602034ZP）

高 寒（1995—），女，碩士研究生，研究方向為藥物新劑型與新技術研究。E-mail: 2353731484@qq.com

賈艾玲（1986—），女，博士研究生，副教授，研究方向為主要從事中藥制劑研究。E-mail: cczyyjal@163.com

徐 偉（1980—），男，博士，教授，研究方向為中藥制劑新技術及中藥新藥開發研究。E-mail: 1272349594@qq.com

[責任編輯 李亞楠]