銀耳多糖為乳化劑制備槲皮素微乳研究

王君文，尹啟蒙，李學艷，易金玉，黃瑩穎，吳文惠, 2, 3, 4，張朝燕, 2, 3, 4*

銀耳多糖為乳化劑制備槲皮素微乳研究

王君文1，尹啟蒙1，李學艷1，易金玉1，黃瑩穎1，吳文惠1, 2, 3, 4，張朝燕1, 2, 3, 4*

1. 上海海洋大學食品學院，上海 201306 2. 國家淡水水產品加工技術研發分中心，上海 201306 3. 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306 4. 農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海 201306

研究以銀耳多糖為乳化劑的槲皮素微乳處方和制備工藝。通過溶解度考察、配伍試驗和偽三元相圖的繪制優選微乳處方；采用銀耳多糖為天然乳化劑，以油相、混合乳化劑及助乳化劑比例為考察因素，粒徑、載藥量及多分散指數（PDI）為評價指標，采用星點設計-效應面法優化槲皮素微乳處方并對其性質、溶出度及穩定性進行評價。槲皮素微乳處方中油相為三乙酸甘油酯（36%）、乳化劑為銀耳多糖（23%）和聚山梨酯80（23%），助乳化劑為PEG400（18%）；所得微乳外觀均一透明，乳化后平均粒徑為（25.04±0.94）nm，Zeta電位為（?13.20±0.68）mV，PDI為0.311±0.030，載藥量為（30.17±1.02）mg/g；溶出度實驗表明，槲皮素60 min在人工腸液和人工胃液的累積溶出度為87.95%和70.47%；儲存穩定性實驗、高速離心和高溫實驗結果表明，微乳的質量穩定。槲皮素微乳制備工藝簡單，可以增加槲皮素的溶解度和溶出度，為相關制劑的進一步研究與開發提供參考。

槲皮素；銀耳多糖；微乳；偽三元相圖；星點設計-效應面法；溶出度；穩定性

槲皮素是一種黃酮類化合物，具有抗病毒、抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌、心血管系統保護等多種功能[1-2]，并且無致癌、致死等反應[3]。但槲皮素的水溶性極差，僅為15.86 μg/mL[4-5]。口服吸收差、生物利用度低是槲皮素主要的缺點。而微乳是水、油、乳化劑和助乳化劑按適當的比例混合，自發形成的各向同性，透明，熱力學穩定的分散體系[6]，可以提高難溶性物質的溶解度，增加藥物與胃腸道的接觸面積，促進藥物的吸收。

微乳體系中乳化劑的使用至關重要，乳化劑能夠改善乳液中各種構成相之間的表面張力，使之形成均勻穩定的分散體系。近年來，銀耳多糖作為一種天然的乳化劑，其乳化性被學者們廣泛研究。黃曉德等[7]研究了不同溫度、銀耳多糖濃度、pH、NaCl濃度條件下，銀耳多糖對桉葉油的乳化能力。結果表明，銀耳多糖對桉葉油有較好的乳化性。Zhang 等[8]在比較銀耳多糖、魔芋膠和阿拉伯膠的乳化性時，發現銀耳多糖具有更好的乳化穩定性，可較長時間保持乳化效果。張珊珊等[9]將銀耳多糖作為一種乳化劑和增稠劑添加到花生蛋白飲料中，所制備的花生蛋白飲料體系穩定，稠度和黏度與市售相當。但目前，尚未有報道將銀耳多糖作為乳化劑來制備微乳的方法。因此，本實驗以槲皮素為原料藥，以銀耳多糖為天然乳化劑，和合成乳化劑聚山梨酯80（T80）混合使用，來制備槲皮素微乳。然后通過星點設計-效應面法優化處方，以期增大槲皮素的溶解度，為相關新劑型的研究奠定基礎，同時為銀耳多糖應用于微乳乳化劑中提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ZEN3600型納米粒度儀，英國Malvern公司；85-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；H1650離心機，湘儀離心機儀器有限公司；RCZ-8型藥物溶出度儀，上海黃海藥檢儀器有限公司；BSA224S型電子分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；XW-80A 型旋渦混合儀，海門市其林貝爾儀器有限公司；L-2130液相色譜儀，日立高新技術集團；TECNAI F30透射電子顯微鏡（TEM），美國FEI公司。

1.2 試劑

槲皮素原料藥（批號117-39-5，質量分數96%）、聚乙二醇800（PEG800）、普魯蘭多糖，九鼎化學科技有限公司；槲皮素對照品，批號117-39-5，質量分數98.5%，上海晶純生化科技股份有限公司；銀耳多糖，批號SQYE20190916，質量分數70%，西安圣青生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉，上海凌峰化學試劑有限公司；聚乙二醇400（PEG400），蘭拓生物科技有限公司；阿拉伯膠，阿拉丁生化科技股份有限公司；海藻多糖，索萊寶生物科技有限公司；00號透明膠囊殼，江蘇長禾膠囊有限公司；油酸乙酯、三乙酸甘油酯、蓖麻油、大豆油、橄欖油、聚山梨酯20（T20）、T80、乙醇，均購于麥克林試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 銀耳多糖的乳化性

銀耳多糖的乳化性測定參照文獻方法[10]，分別稱取5 mg銀耳多糖、阿拉伯膠、普魯蘭多糖、海藻多糖，加入100 mL的蒸餾水，不斷攪拌，配制成5 mg/mL的溶液，分別取50 mL溶液與等體積的三乙酸甘油酯混合，5000 r/min下均質1 min，將液體轉移至10 mL離心管中，60 ℃水浴加熱30 min后冷卻至室溫，于5000 r/min離心5 min，觀察離心管內乳濁液的乳化情況。按照以下公式計算樣品的乳化性（ES）。結果如表1所示，銀耳多糖的ES值要大于阿拉伯膠、普魯蘭多糖、海藻多糖。表明，銀耳多糖的乳化性要優于阿拉伯膠、普魯蘭多糖和海藻多糖。所以，將銀耳多糖作為微乳的乳化劑具有一定的可行性。

ES=/

為乳化層高度，為離心管內液體總高度

2.2 槲皮素的含量測定

2.2.1 色譜條件[11]Waters C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.4%磷酸水溶液（60∶40）；體積流量1 mL/min；檢測波長374 nm；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取槲皮素15 mg于50 mL量瓶中，甲醇溶解稀釋，配制成質量濃度為300 μg/mL的對照品儲備液。

2.2.3 供試品溶液的配制 精密量取微乳適量，置于100 mL量瓶中，甲醇超聲破乳溶解并定容，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 線性關系考察 分別取對照品溶液，甲醇稀釋配制成質量濃度分別為6、15、30、60、150、300 μg/mL的系列槲皮素對照品溶液。在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以進樣量為橫坐標（），峰面積為縱坐標（）進行線性回歸，得回歸方程＝23.546＋2.343 1，2＝0.999 1，線性范圍為6～300 μg/mL。

2.3 槲皮素在輔料中溶解度測定[12]

采用振搖法測定槲皮素在油相（油酸乙酯、三乙酸甘油酯、蓖麻油、大豆油、橄欖油）、乳化劑（T80、銀耳多糖、T20）和助乳化劑（乙醇、丙三醇、PEG400、PEG800）中的飽和溶解度。精密稱取上述輔料各2 g于西林瓶中，加入過量的槲皮素，渦旋混合1 min后，37 ℃下連續振蕩24 h，于5000 r/min離心15 min，取上清液用甲醇稀釋，按照“2.2”項方法測定槲皮素的質量濃度。

原則上采取對槲皮素有較高溶解度的油相、乳化劑、助乳化劑作為微乳的組成成分，以防止在儲存過程中藥物析出結晶[13]。槲皮素在各種油相、乳化劑和助乳化劑中的飽和溶解度如表2所示。在篩選的油相中，槲皮素在蓖麻油和三乙酸甘油酯中的溶解度最高，分別為2.31、2.08 mg/mL；在篩選的乳化劑中，在T20中的溶解度最高，為24.12 mg/mL；在篩選的助乳化劑中，在PEG400和PEG800中溶解度最高，分別為166.28、72.37 mg/mL。基于結果，最終選擇蓖麻油和三乙酸甘油酯作為油相，PEG400和PEG800作為助乳化劑進一步用于處方的篩選。

2.4 配伍試驗

2.4.1 油相與乳化劑的篩選 分別將油相（蓖麻油、三乙酸甘油酯）與乳化劑（T80、銀耳多糖、T20）按照質量比為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5渦旋混合5 min，室溫下靜置，取空白微乳1 g，滴入100 mL的蒸餾水，100 r/min磁力攪拌，觀察乳化情況，根據目測評價標準進行等級分類[13]。結果顯示，在考察的用量比例范圍之內，三乙酸甘油酯與T80、銀耳多糖、T20配伍后相容性和乳化性能均較好，而蓖麻油與乳化劑配伍后相容性和乳化性能較差，形成白色凝膠物狀，因此選擇三乙酸甘油酯作為油相。因現有的合成乳化劑中不管用于何種給藥途徑，均不同程度地出現各種毒性[14-15]，聚山梨酯類中T20的毒性大于T80，因此選用T80和銀耳多糖作為乳化劑。

2.4.2 助乳化劑的篩選 分別將銀耳多糖和T80與PEG400和PEG800按質量比1∶1混合，再將混合物與油相按質量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5渦旋混合5 min，室溫下靜置，取空白微乳1 g，滴入100 mL的蒸餾水，100 r/min磁力攪拌，觀察助乳化劑乳化情況。結果顯示，PEG400和PEG800助乳化性能相似，因PEG400的載藥量較大，且具有與各種溶劑的廣泛相容性，是很好的溶劑和增溶劑，所以選擇PEG400作為助乳化劑。

2.5 偽三元相圖的繪制[16]

通過偽三元相圖確定銀耳多糖和T80比例，將銀耳多糖和T80以1∶1、2∶1、1∶2混勻，再與PEG400按1∶1混勻，然后按質量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，加入三乙酸甘油酯，磁力攪拌條件下，滴加蒸餾水至形成澄清透明的微乳，記錄臨界變化的加水量。通過Origin 9.1軟件將臨界點時三乙酸甘油酯、銀耳多糖、T80、水各自質量分數繪制成偽三元相圖，其3個頂點分別為油相、混合乳化劑、水。將能形成澄清或帶有藍色乳光的實驗點定為偽三元相圖中可形成微乳的處方點，連接這些點與水相頂點形成的封閉區域，即為微乳區[16]，結果見圖2，微乳區域面積越大，可形成微乳的處方越佳，最終確定銀耳多糖和T80最佳比例為1∶1。

2.6 星點設計-效應面法優化處方

2.6.1 試驗設計 星點設計是效應曲面中常用的設計方法，具有試驗次數少、精度高等特點，其應用較為成熟[17-18]。本研究選擇對微乳形成有顯著影響的2個因素作為考察指標，即油相質量分數（1）、混合乳化劑與助乳化劑的比例m（2），油相質量比范圍為10%～40%，m值為0.5～3.0，兩因素的對應水平見表3。以微乳的載藥量、粒徑以及粒徑的PDI為指標，確定最優處方。按照表4中處方比例精密稱取油相、混合乳化劑、助乳化劑，渦旋混勻1 min，得空白微乳。精密稱取空白微乳2 g，加入過量的槲皮素，渦旋混勻1 min，37 ℃下連續振蕩24 h，得槲皮素微乳。精密稱取槲皮素微乳1 g，加37 ℃水10 mL，100 r/min磁力攪拌至乳化完全，納米粒度儀測定粒徑和PDI。精密稱取槲皮素微乳0.5 g，5000 r/min離心15 min，取上清液用甲醇稀釋至適宜質量濃度，按照“2.2”項的方法進行測定，計算載藥量。

2.6.2 模型擬合和方差分析 使用Design-Expert 8.0軟件對數據進行多元回歸線性擬合，得到2次多項式方程＝0＋11＋22＋312＋412＋522；而以載藥量、粒徑和PDI對數據進行擬合得到的回歸方程分別為1＝29.99－29.141－25.772＋36.2312＋13.8612＋8.5222，2＝0.998 9，2adj＝0.997 4，＜0.000 1；2＝21.09＋11.901－19.702－7.1312＋5.2212＋14.8022，2＝ 0.980 3，2adj＝0.960 7，＜0.01；3＝0.45＋0.161－0.122－0.05412＋8.6612－0.07622，2＝0.958 7，2adj＝0.950 3，＜0.01。再進行方差分析，可知各模型＜0.01，模型水平顯著；失擬項＞0.05，相對于純水平誤差不顯著；2、2adj均＞0.95。表明2次多項式擬合結果較好，具有代表性，能客觀準確地根據自變量的變化進行預測[12]。

2.6.3 效應面分析 由圖3-a可知，隨著油相比例的增加，微乳的載藥量顯著降低；當油相比例一定時，微乳的載藥量隨著m（混合乳化劑/助乳化劑）值的增加而減小，原因可能是m值越小，PEG400的含量越高，載藥量越大。由圖3-b可知，乳化后的粒徑隨著油相比例的增加而增大，適當地減少油相的比例，增加乳化劑的含量可使微乳的粒徑減小。由圖3-c可知，m值越大，乳化劑含量越高，PDI值越小，微乳體系越穩定。根據擬合方程，Design-Expert 8.0軟件三維效應面圖綜合分析結果，在實驗室范圍內以載藥量大小、粒徑和PDI為原則，確定最優處方油相（三乙酸甘油酯）、乳化劑（銀耳多糖-T80 1∶1）、助乳化劑（PEG400）質量比為36∶46∶18，即1＝35.61，2＝2.63。

2.6.4 最佳處方驗證 最佳處方油相（三乙酸甘油酯）、乳化劑（銀耳多糖-T80 1∶1）和助乳化劑（PEG400）的比例為36∶46∶18。測得的平均粒徑為（25.04±0.94）nm，PDI值為0.311±0.030，最大載藥量為（30.17±1.02）mg/g。結果見表5，可知實際值與預測值相當，所建模型預測性良好。

2.7 處方質量評價

2.7.1 外觀和形態 在室溫（20 ℃）下，槲皮素微乳呈現黃色。將微乳濃縮液用蒸餾水稀釋100倍后，可得澄清透明的黃色溶液。取槲皮素微乳適量，37 ℃水稀釋100倍，取適量微乳滴在銅網上，10 min后，用濾紙吸去多余液體，2%磷鎢酸溶液負染色2 min，晾干后，于透射電鏡下觀察[13]，結果顯示，微乳液滴較小，呈球形（圖4）。

圖3 因素X1、X2對槲皮素微乳處方載藥量(a)、粒徑(b)和PDI (c)影響的效應面

2.7.2 粒徑、PDI和Zeta電位 取槲皮素微乳0.1 g加入10 mL水中，攪拌均勻，取1 mL加入樣品池，輕輕震搖，放入ZEN3600型納米粒度儀中，測定粒徑分布及Zeta電位。每份樣品測定3次，取平均值。結果顯示，槲皮素微乳的平均粒徑為（25.04±0.94）nm，PDI值為0.311±0.030，Zeta電位值為（?13.20±0.68）mV。表明所制備的微乳粒徑較小，分布較窄，體系較穩定。

圖4 槲皮素微乳TEM圖(100 nm)

2.8 溶出度評價

溶出度的測定方法參照文獻報道[11]，分別以人工胃液（simulated gastric fluid，SGF）、人工腸液（simulated intestinal fluid，SIF）、水作為溶出介質，體積均為500 mL，溫度為（37.0±0.5）℃，攪拌槳轉速為（50±1）r/min。將1 g槲皮素微乳（30 mg槲皮素原料藥）放入00號透明膠囊殼中，開啟儀器，分別在5、10、20、30、45、60 min取出溶出介質5 mL，同時補足等溫等體積溶出介質，按照“2.2”項的方法，測定槲皮素的含量。同法，將30 mg原料藥加入透明膠囊殼中，按照上述操作測槲皮素原料藥累積溶出率，繪制溶出曲線，結果見圖5。由圖可知，SIF和SGF可以顯著提高藥物的溶出速率，10 min時藥物已基本溶出。60 min時，槲皮素微乳在SIF、SGF、水中溶出速率已達到87.95%、70.47%、29.62%，而槲皮素原料藥在SIF、SGF、水中的溶出速率僅為20.09%、13.91%、9.13%。在SIF、SGF、水中，以微乳的形式，槲皮素的溶出速率分別提高了67.86%、56.56%、20.49%，溶出度實驗表明微乳可有效提高槲皮素的溶出速率。

2.9 穩定性實驗

穩定性實驗參照國家食品藥品監督管理局于2006年頒布的《中藥、天然藥物穩定性研究技術指導原則》。

2.9.1 儲存穩定性實驗 將微乳常溫放置60 d，分別于第0、1、3、7、15、30、60 d測定微乳的粒徑、電位、PDI、載藥量，結果見表6。30 d時，微乳的粒徑、電位、PDI、載藥量變化趨于穩定，且微乳外觀澄清透明，無分層現象。儲存穩定性實驗表明，所制備的微乳體系較穩定。

2.9.2 高速離心實驗 取微乳1 g于10 000 r/min離心15 min，離心后微乳外觀澄清透明，無沉淀，無分層現象。

2.9.3 溫度對微乳穩定性的影響 將4份等量微乳分裝玻璃瓶中，擰緊瓶蓋。分別于70、80、90、100 ℃下水浴加熱30 min后，冷卻至室溫。24 h后觀察微乳的外觀、測定微乳的粒徑及粒徑分布、Zeta電位及藥物含量有無變化[19]。結果顯示，外觀上微乳未出現分層、沉淀等現象；70～100 ℃處理后微乳的粒徑由25.04 nm增大到35.78 nm，粒徑分布圖上微乳仍然呈現單峰，但微乳的體積分數減小，微乳的數量分布略有縮小（圖6），可能熱處理使粒子對乳化劑的吸附作用減弱，乳膠粒周圍的雙電層減薄，粒子聚并增多。

不同加熱處理后微乳Zeta電位和槲皮素的質量分數變化如圖7所示，電位由?13.2 mV上升到?9.11 mV；而微乳中槲皮素的質量分數由76.5%降到74.37%，降低2.13%。結果表明乳液經過熱處理后仍然維持較好的貯藏穩定性，所制備的微乳體系較為穩定。

3 討論

微乳處方的篩選關鍵在于合適的油相、乳化劑和助乳化劑。其中，油相的種類影響微乳的乳化效果，而本實驗選擇的三乙酸甘油酯與乳化劑和助乳化劑的配伍效果較好。乳化劑的種類和用量將影響乳滴的粒徑，進而影響微乳的穩定性。高HLB的乳化劑可以促進水包油型微乳的形成及促進其在水中的擴散。本實驗選擇的T80具有較高的HLB值（15.0），可以抑制P-糖蛋白對藥物的外排作用[20]，促進藥物的吸收。而天然乳化劑銀耳多糖具有一定的分子極性，可以與油滴微表面以范德華力的形式相互結合，防止液滴之間的聚合[21]，且多糖具有一定的黏度，可以削弱油滴分子之間因布朗運動而造成的自動聚合[22]，有效提高乳液的穩定性。本實驗篩選的助乳化劑PEG400已廣泛應用于食品、藥品領域，具有安全性高、穩定性好等優點，且槲皮素在其中的溶解度最高，選擇其作為助乳化劑對提高微乳的載藥量及穩定性具有重要意義。

圖6 不同溫度處理后微乳的粒徑分布圖

圖7 不同溫度處理后微乳的Zeta電位和槲皮素質量分數

傳統微乳中乳化劑濃度過高引起的毒性是限制其應用的主要因素之一。所以，有研究學者使用天然乳化劑阿拉伯膠來制備微乳。陳莉等[23]研究阿拉伯膠對綠原酸自微乳體內外性能的影響。結果表明，含阿拉伯膠的新型綠原酸自微乳在十二指腸、空腸、回腸的吸收量增加，新型綠原酸自微乳可以促進綠原酸在小腸的吸收。黃嗣航等[24]在對比含有阿拉伯膠的新型葛根素自微乳和傳統自微乳性能中發現，新型葛根素自微乳和傳統自微乳性的自乳化速率基本一致，含阿拉伯膠的自微乳對葛根素的促進吸收效果優于傳統自微乳。而阿拉伯膠和銀耳多糖屬于天然乳化劑，且都具有葡萄糖醛酸等結構。所以，含銀耳多糖的槲皮素微乳可能比傳統的槲皮素微乳吸收效果更好，在體內應用方面具有一定的發展前景。

溶出度實驗是模擬藥物在體內溶出的關鍵步驟。在溶出度實驗中，在SIF、SGF 60 min時槲皮素的累積釋放率可達到87.95%、70.47%，相較于槲皮素原料藥，槲皮素微乳呈現釋放率高的特點。因此，本研究成功制備了含天然乳化劑銀耳多糖的槲皮素微乳，降低了T80的一半用量，提高了槲皮素的溶出度，具有一定的實用價值和經濟價值，為天然藥物的研究應用提供了新的思路，后續將從其藥效、臨床應用等方面開展研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation of quercetin microemulsion withpolysaccharide as emulsifier

WANG Jun-wen1, YI Qi-meng1, LI Xue-yan1, YI Jin-yu1, HUANG Ying-ying1, WU Wen-hui1, 2, 3, 4, ZHANG Chao-yan1, 2, 3, 4

1. Food Science School, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China 2. National Freshwater Aquatic Products Processing Technology R&D Center, Shanghai 201306, China 3. Shanghai Seawater Product Processing and Storage Engineering Technology Research Center, Shanghai 201306, China 4. Ministry of Agriculture Aquatic Product Storage Quality and Safety Risk Assessment Laboratory, Shanghai 201306, China

To study the prescription and preparation process of quercetin microemulsion containingpolysaccharide as emulsifier.The prescription was optimized through solubility investigation, compatibility test and ternary phase diagram method.polysaccharide was used as natural emulsifier, the ratio of oil phase, mixed emulsifier and co-emulsifier were used as the examination factors, and particle size, drug loading capacity and polydispersity index (PDI) were used as evaluation indicators. The central composite design-response surface method was used to optimize the formulation of quercetin microemulsion and evaluate its properties, dissolution and stability.The oil phase of the quercetin microemulsion prescription was glycerol triacetate (36%), the emulsifier waspolysaccharide (23%) and T80 (23%), and the co-emulsifier was PEG400 (18%); The resulting microemulsion had uniform and transparent appearance; The average particle size was (25.04 ± 0.94) nm, the potential was (?13.20 ± 0.68) mV, the PDI was 0.311 ± 0.030, and the drug loading was (30.17 ± 1.02) mg/g. The dissolution test showed that the cumulative dissolution rate of quercetin in simulated intestinal fluid and simulated gastric fluid at 60 min was 87.95% and 70.47%. Preliminary stability test, high-speed centrifugation and high-temperature test results showed that the quality of microemulsion was stable.The preparation process of quercetin microemulsion is simple, which can increase the solubility and dissolution of quercetin, and provide reference for further research and development of related preparations.

quercetin;polysaccharide; microemulsion; pseudo-ternary phase diagram; central composite design-response surface method; dissolution; stability

R283.6

A

0253 - 2670(2021)02 - 0378 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.010

2020-09-01

國家自然科學基金項目（81750110548）

王君文（1996—），女，碩士研究生，研究方向為中藥新制劑、新劑型、新技術。Tel: 16621525121 E-mail: wendywww1996@163.com

張朝燕，女，副教授，碩士生導師，研究方向為中藥新制劑、新劑型、新技術。Tel: 15692165855 E-mail: chyzhang@shou.edu.cn

[責任編輯 鄭禮勝]