姜黃素聯合有氧運動對骨質疏松大鼠骨密度、氧化應激能力及骨組織NF-κB的影響

楊青坡 穆合塔爾·買買提熱夏提 王法正* 高廣文 付岳松

1.新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院運動醫學科，新疆 喀什 844000 2.新疆維吾爾自治區哈密市中心醫院骨科，新疆 哈密 839000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)患者臨床特征較為明顯，骨量減少、骨組織結構突變為特征，是老年人群中多發的骨骼系統疾病[1]?，F代醫學認為，骨質疏松是由于骨骼形成能力低于骨吸收速度所致，臨床西醫的治療藥物價格偏高、患者耐受程度、藥物吸收程度不同，遠期療效欠佳[2]。機體組織由于老化、炎癥、雌激素缺乏等原因使線粒體損傷，發生氧化應激反應，導致NF-κB炎癥信號的激活，減少骨細胞形成，使骨細胞增殖，分化能力降低，加重病情[3-4]。姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗纖維化、抗病毒及免疫調節等藥理作用，其對骨質疏松亦有一定的防治作用，但關于其作用機制尚未完全闡明[5]。運動干預在改善骨質疏松上有重要作用，且不會增加患者腎臟負擔，還能減少藥物對患者身體的進一步損害[6]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

姜黃素200 mg/kg(南京景竹生物)，Trizol試劑(浙江AMEKO)，逆轉錄試劑盒(武漢賽維爾)，RPMI-1640培養基(上海一研)，直線數字化雙能 X 線骨密度儀(法國邁迪)。

1.2 模型建立和分組

自廣東省醫學實驗動物中心購買40只體重為180～225 kg的SPF級雌性大鼠，按照骨密度水平平均分成4組，Dd組(OP模型+姜黃素)、Lh組(OP模型+姜黃素+有氧運動)、Op組(OP模型)、Zc組(假手術組)。

1.3 治療方法和有氧運動

姜黃素干預方法參考文獻[7]。大鼠自由活動，Lh組除正?；顒油饷咳者€要進行跑臺訓練，前2周適應性訓練。跑步速度從最開始的10 m/min逐漸增加到25 m/min，訓練時間從最開始的15 min/d逐漸增加到60 min/d，從第三周開始，每天的訓練時間固定為60 min/d，共訓練10周[8]。

1.4 骨密度、氧化應激能力測定

血清NOS、SOD活力、MDA水平檢測：取大鼠尾靜脈血，離心分離血清，運用生化法測血清中NOS、SOD活力、MDA水平。骨密度：采血完畢后，麻醉大鼠處死，取股骨，利用X射線骨密度儀測定大鼠股骨密度。組織提取參考文獻[8]。

1.5 骨小梁體積百分比檢測

將低溫保存骨組織，采用全自動圖像數字化學分析儀檢測骨小梁體積百分比(TBV%)：指骨小梁體積占骨髓腔總體積的百分比。

1.6 HE染色

將大鼠右側脛骨切片后，甲醛溶液固定，脫水時用乙醇溶液，石蠟包埋后切片4 μm，封閉時中性樹膠，蘇木精和伊紅染色液復染分別為6～8 min和10 s，于顯微鏡下觀察骨組織結構改變情況。

1.7 RT-PCR檢測NF-κB水平變化

將胰蛋白酶加入大鼠右側脛骨組織中進行消化反應，總RNA采用rizol法來提取，總RNA提取反轉錄成 cDNA，按全說明書進行實驗，內參采用β-actin，60℃，10 min，95 ℃、72℃，各 30 s，95 ℃，5 min，循環次數以40為準，實驗次數至少3次，用相對定量2-ΔΔCT計算NF-κB表達。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 Western blot法檢測NF-κB蛋白表達

取大鼠右側脛骨組織用PBS溶液來洗滌，并與胰蛋白酶提取液按照1∶100進行混合，使組織完全裂解，成為E溶液；在EP管中按照1∶100比例加入胰蛋白酶提取液2 mL，使組織完全裂變成為F溶液，把E和F溶液以80∶1的體積進行搖勻，放入37.5 ℃的保溫箱中20 min，冷卻后計算NF-κB蛋白濃度。

1.9 統計學分析

用 SPSS 19.0 軟件對各組的指標變化情況進行統計和分析，用均值±標準差表示計算出的結果，Dd組、Lh組、Op組、Zc組進行對比，采用χ2或t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨密度變化情況

與Zc組比較，其余3組腿股骨骨密度均下降(P<0.05)，與Op組比對，Dd組腿股骨骨密度提升(P<0.05)，與Dd組比對，Lh組骨密度增長(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠骨密度變化情況Fig.1 Changes of bone mineral density of rats in each group注：與Dd組比較，aP<0.05；與Lh組比較，bP<0.05；與Op組比較，cP<0.05。

2.2 骨小梁體積百分比比較

Zc組骨小梁體積百分比[(29.15±5.45)%]顯著高于OP組[(10.11±4.09)%](P<0.05)，Dd組后升高至(21.08±5.03)%，聯合運動干預后LH組為(25.55±6.33)%，均與OP組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 氧化應激能力

骨質疏松大鼠Op組GSH-Px、SOD值下降、MDA值升高(P<0.05)，運動聯合藥物干預后Lh組大鼠GSH-Px、SOD值升高、MDA值下降(P<0.05)，4組氧化應激能力比對差距顯著(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠氧化應激能力Table 2 Oxidative stress capacity of rats in each group

2.4 HE染色

Zc組骨小梁結構良好未有明顯病理改變，Op組骨小梁病理改變較重，骨小梁粗細不均，排列不規則，且有多處骨髓區未見骨小梁結構，Dd組較Op組有所好轉，部分骨髓區無骨小梁結構，排列狀態好于Op組，Lh組部分骨小梁結構恢復正常，骨髓區均有骨小梁結構出現，僅有少數排列不均。見圖2。

圖2 各組大鼠HE染色(×200)Fig.2 HE staining of rats in each group (×200)

2.5 RT-PCR檢測NF-κB mRNA水平變化

與Zc組比對，Op組大鼠NF-κB mRNA水平上升(P<0.05)，與Op組比對，Dd組、Lh組大鼠NF-κB mRNA水平均下降(P<0.05)，且Lh組NF-κB mRNA水平低于Dd組(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠NF-κB mRNA水平變化情況Fig.3 Changes of NF-κ B mRNA level of rats in each group注：與Dd組比較，aP<0.05；與Lh組比較，bP<0.05；與Op組比較，cP<0.05。

2.6 Western blot法檢測NF-κB蛋白表達

與Zc組比對，Op組NF-κB蛋白上升(P<0.05)，與3組大鼠NF-κB蛋白下降(P<0.05)，且Lh組NF-κB蛋白表達低于Dd組(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠NF-κB蛋白表達變化Fig.4 Changes of NF-κ B protein expression of rats in each group注：與Dd組比較，aP<0.05；與Lh組比較，bP<0.05；與Op組比較，cP<0.05。

3 討論

姜黃素從姜科植物根莖中提取出來，在抑制過氧化反應較為出色，同時具有抗炎癥作用[9-10]。NF-κB轉錄調控眾多疾病因子，不少研究均已證實NF-κB 在OP的發生、發展過程中有重要作用[11]。研究顯示，適度舒適的有氧運動會使大腦分泌一種生物活性物質，可與腦循環的免疫細胞結合，幫助免疫細胞維持正常功能，增加抗氧化酶SOD等活性，通過調控細胞對OP患者骨組織起到保護作用[12-13]。

OP大鼠組織中GSH-Px、SOD活性降低，使不飽和脂肪酸受到攻擊，導致組織細胞膜磷脂出現過氧化，通過有氧運動干預手段提升其活性后，病情能得到明顯改善[14]。OP患者機體組織細胞呈現過氧化狀態，自由基的氧化性改變，發生糖基化，導致抗氧化系統功能異常使骨質疏松癥狀加重，而姜黃素有清除自由基的作用。有研究者證實，姜黃素對去卵巢絕經后OP大鼠、甲酸誘導OP大鼠的骨組織均有保護作用，促進骨小梁再生，提高骨密度并通過誘導抗氧化酶將多種超氧化物、過氧化物進行分解或還原從而起到抗氧化的作用。

有文獻報道，炎癥信號最先轉入細胞膜中，通過細胞中I-κB 激酶等途徑使增加NF-κB活性進行特異性識別，出現基因轉錄和調控引發炎癥損傷，NF-κB 的活性增加引起免疫抑制，使OP處于進展狀態。本實驗中大鼠由于雌激素缺乏出現骨質疏松癥狀，而雌激素缺乏會使機體出現氧化應激及炎癥反應，導致骨小梁數量減少、厚度變薄、骨密度降低等狀況發生。有研究證實，姜黃素可作用于靶基因減弱NF-κB 活性，對炎性因子的釋放產生抑制效果，能夠顯著抑制果酸、雌激素缺乏大鼠的OP發展進程。目前臨床上已經把運動和藥物治療聯合在一起，大量文獻表明骨質疏松后經過臨床治療和運動訓練是可以改善患者的病情，有些患者還可以提高生活自理能力，骨質疏松患者沒有經過長期的運動訓練僅僅依靠藥物治療，恢復的能力和患者的體質和心理狀況，都遠不及參加運動和臨床一起治療的患者的恢復程度[15]。

綜上所述，姜黃素聯合有氧運動能明顯改善OP大鼠骨密度、氧化應激能力，降低骨組織中NF-κB表達。