Micro PET/CT觀察三七總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠模型腦葡萄糖代謝的影響

彭一檬，余 錄，譚 華，尤 強，張春銀*

(1.遂寧市中心醫院放射科，四川 遂寧 629000；2.西南醫科大學附屬醫院核醫學科，四川 瀘州 646000)

腦缺血再灌注損傷病理生理反應較為復雜。葡萄糖轉運蛋白(glucose transporter, GLUT)可能是治療腦缺血再灌注損傷的新靶點，上調GLUT表達有利于缺血缺氧腦組織轉運葡萄糖，從而緩解能量代謝衰竭，維持細胞內外離子濃度梯度，減輕腦組織水腫[1]。三七總皂苷(Panax notoginseng total sapoins， PNS)對大鼠腦缺血再灌注損傷模型具有神經保護作用[2]。本研究采用Micro18F-FDG Micro-PET/CT半定量分析腦缺血再灌注損傷模大鼠型腦葡萄糖代謝，以免疫組織化學分析GLUT表達，觀察PNS對腦缺血再灌注損傷大鼠腦葡萄糖代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡健康雄性SD大鼠40只，由西南醫科大學動物中心提供[許可證號：SCXK(川)2018-065]；清潔級Ⅱ級，體質量250～300 g，以標準動物飼料喂養，12 h明暗交替光照。采用單純隨機抽樣法將大鼠分為正常組、模型組、假手術組及PNS組，每組10只。

1.2 建立模型 采用改良線栓法建立大腦中動脈阻塞再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion， MCAO/R)模型[3]。對模型組及PNS組大鼠經腹腔注射10%水合氯醛(3 ml/kg體質量)麻醉，于頸前偏右側切口，鈍性分離并暴露右側頸部血管，結扎并剪斷頸外、頸內-外交通動脈后結扎翼鄂動脈，夾閉頸總動脈，頸內動脈繞線備用；于右頸外動脈近心端剪一倒“V”形小口，經此插入線栓(直徑約為0.32 mm)，插入1.8～2.0 cm后遇到阻力立即停止；結扎備用線，固定線栓后松開動脈夾；阻斷1 h后拔出線栓，逐層縫合術區組織。假手術組插線深度約1.0 cm，1 h后拔出線栓縫合組織，其余操作相同。正常組僅麻醉，不予手術。

參照文獻[4]標準評價神經功能缺損：神經功能正常為0分；提尾時，大鼠左前肢伸展程度與對側不一致為1分；自由行走時向左側轉圈為2分；自由行走時向左側傾倒為3分；無自發行走，但意識存在為4分；死亡與缺血有關為5分。術后2 h評分為1～4分且Micro PET/CT顯示右側大腦半球出現糖代謝減低區提示判斷造模成功。排除造模不成功及意外死亡大鼠，隨機抽取同級別大鼠進行補充造模，保證模型組及PNS組各10只，共20只大鼠為腦缺血再灌注損傷模型。

1.3 藥物干預 以建模成功后3 h為干預起始時間點，對PNS組每日1次經腹腔注射PNS(濃度11.5 mg/ml)，劑量為115 mg/kg體質量[5]，連續3日給藥；其余3組以等體積(10 ml/kg體質量)0.9%生理鹽水代替PNS。

1.4 PET/CT掃描及圖像分析 采用Siemens Inveon Multimodality System Micro PET/CT，配備Inveon集成工作平臺和ASI Pro VM分析軟件系統。18F-FDG(放射化學純度>98%，pH為5.6)由西南醫科大學附屬醫院核醫學科提供，以Siemens Cyclotron RD型加速器制備。分別于造模成功后2、6、24、48及72 h進行顯像，之前均停飼8 h并測定空腹血糖。俯臥位保定大鼠，腹腔麻醉后，經尾靜脈注射18F-FDG 18.5～37.0 MBq(約0.2 ml)，40 min后采集圖像：CT采集曝光200 ms，以COBRA濾波反投影(filter back projection， FBP)進行重建，PET采集耗時約10 min，以2D-FBP進行重建。由2名具有2年以上工作經驗的醫師采用ASI Pro VM軟件觀察腦缺血部位及范圍,勾畫感興趣容積(volume of interest， VOI),以糖代謝減低區為VOI 1，其鏡像區域為VOI 2，測量標準攝取值(standardized uptake of value， SUV)。

1.5 免疫組織化學檢測腦GLUT 兔抗鼠GLUT-1及GLUT-3抗體購自Bioworld公司。于建模成功72 h且PET/CT顯像后摘取大鼠腦組織，制作石蠟切片，行免疫組織化學染色，以Image J軟件測定平均光密度值。

1.6 統計學分析 采用SPSS 24.0統計分析軟件，計量資料以±s表示，以重復測量方差分析比較各時間點組間及組內SUV差異；以獨立樣本t檢驗比較組間GLUT平均光密度值，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.118F-FDG Micro PET/CT圖像視覺及SUV 正常組及假手術組大鼠腦實質葡萄糖糖代謝均勻。模型組及PNS組大鼠術后2 h 右側大腦半球均見葡萄糖代謝減低區，18F-FDG攝取明顯低于鏡像側；術后6 h缺血灶糖代謝減低程度加重、范圍稍擴大，此后模型組糖代謝減低區范圍變化不明顯，PNS組糖代謝減低區范圍逐漸縮小，18F-FDG攝取逐漸增高，見圖1。

2.2 缺血灶及周圍腦組織SUV 術后2 h 正常組、模型組、假手術組及PNS組間SUV差異均無統計學意義(P均>0.05)。術后6、24、48及72 h，模型組及PNS組SUV均低于正常組和假手術組(P均<0.05)，而PNS組均高于模型組(P均<0.05)。術后6 h 缺血灶18F-FDG攝取水平達到最低，之后SUV不同程度恢復；各時間點正常組及假手術組SUV差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表1。

2.3 GLUT-1及GLUT-3表達 GLUT-1主要表達于微血管內皮細胞(圖2)，GLUT-3主要表達于神經元細胞(圖3)，陽性表達細胞呈棕黃色；正常組和假手術組GLUT-1、GLUT-3陽性表達細胞數目均少于模型組和PNS組。術后72 h 模型組及PNS組GLUT-1和GLUT-3平均光密度值均高于正常組(P均<0.05)，模型組高于假手術組(P<0.05)，PNS組高于模型組及假手術組(P均<0.05)；假手術組GLUT-1(t=-1.88，P=0.07)及GLUT-3平均光密度值(t=-1.2，P=0.21)與正常組比較差異均無統計學意義，見表2。

3 討論

缺血、缺氧時，腦組織主要依靠無氧酵解，ATP減少、ADP增加，線粒體等細胞器因缺乏營養物質而受損；ATP減少使得Na-K-ATP酶活性降低，細胞內Na+濃度升高，導致細胞毒性腦水腫，進一步加重損傷[6-7]。葡萄糖是腦組織代謝的唯一能量來源，是必須依賴GLUT進入腦組織的極性分子；提高GLUT表達可起到神經保護作用，緩解能量代謝衰竭[1]。

圖1 各組不同時間點Micro PET/CT圖

表1 各組大鼠右側大腦半球VOI 的SUV(±s，n=10)

表1 各組大鼠右側大腦半球VOI 的SUV(±s，n=10)

注：*：與正常組比較P<0.05；#：與模型組比較P<0.05；▲：與假手術組比較P<0.05

組別術后顯像時間(h)26244872F值P值正常組3.96±0.143.92±0.173.89±0.193.99±0.163.99±0.160.71>0.05模型組2.08±0.140.90±0.03*1.23±0.07*1.38±0.07*1.65±0.03*281.54<0.01假手術組3.93±0.163.99±0.11#3.95±0.15#3.93±0.11#3.91±0.14#0.53>0.05PNS組2.11±0.190.98±0.06*#▲1.43±0.09*#▲1.71±0.04*#▲1.96±0.07*#▲163.02<0.01

圖2 腦組織GLUT-1免疫組織化學染色(×100) A.正常組； B.模型組； C.假手術組； D.PNS組

圖3 腦組織GLUT-3免疫組化織化學染色(×100) A.正常組； B.模型組； C.假手術組； D.PNS組

表2 各組大鼠腦組織GLUT-1及GLUT-3免疫組織化學染色平均光密度值

本研究中，術后6、24、48及72 h，PNS組病灶SUV均高于模型組；隨時間推移，病灶體積逐漸縮小，糖代謝逐漸增高，各時間點SUV差異均具有統計學意義。模型組及PNS組GLUT-1、GLUT-3表達較正常組和假手術組均有所上調；PNS組平均光密度值高于模型組，提示PNS可提高缺血灶GLUT表達，進而提高糖代謝。

PNS影響腦缺血再損傷后葡萄糖代謝的機制目前尚未明確。鐘森等[8-10]認為PNS上調GLUT-1/3表達，有利于葡萄糖轉運及提高腦組織中ATP、ADP及AMP含量，從而提高腦組織能量代謝；而CHENG等[11]提出PNS主要通過調節三羧酸循環和氧化呼吸鏈中的關鍵酶活性而有效抑制乳酸脫氫酶漏出，從而維持線粒體生理功能及正常能量代謝。安冬等[12-13]發現，PNS除影響腦能量代謝外，還可通過上調神經膠質谷氨酸轉運體表達，清除細胞外、突觸間隙過量谷氨酸而降低微血管通透性，改善微循環，促進血管生成，增加缺血組織血流灌注，調控凋亡信號通路等機制，以起到神經保護作用。

本研究通過PNS對18F-FDG攝取的影響評價其對缺血灶葡萄糖代謝率的作用，從而評估其療效。BUNEVICIUS等[14]將18F-FDG攝取與腦葡萄糖代謝率的比值稱為集總常數，默認值為1.0，即默認18F-FDG攝取與腦葡萄糖代謝率無差異；集總常數與物種及缺血時間相關，理論上同一時間點大鼠的集總常數是相同的，而腦缺血時大鼠集總常數增加20%～78%。FUKUMOTO等[15]研究證實18F-FDG攝取增高與腦缺血激活小神經膠質細胞及聚集巨噬細胞相關。本研究未以相應顯像劑排除炎癥反應所致18F-FDG攝取增高，但光鏡下觀察病灶區未見明顯炎性細胞存在，由此可排除炎癥反應對18F-FDG攝取的影響。

綜上，18F-FDG攝取差異可反映大鼠腦葡萄糖代謝的變化趨勢，采用Micro PET/CT可動態觀察PNS對葡萄糖代謝的影響；PNS可通過上調腦GLUT-1/3表達促進腦葡萄糖轉運，從而緩解能量衰竭，對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用。