2型囊泡單胺轉(zhuǎn)運體分子探針18F-FP-(+)-DTBZ縱向定量評價2型糖尿病大鼠腦多巴胺能神經(jīng)元

姜東朗，潘智偉，肖見飛，黃 琪，任樹華，華逢春，管一暉，謝 芳

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院PET中心，上海 200235)

糖尿病(diabetes mellitus， DM)和帕金森病(Parkinson disease， PD)是威脅人類健康的常見慢性疾病，發(fā)病率均呈逐年上升趨勢[1]。DM與PD之間可能存在緊密聯(lián)系[2-4]，但具體機制尚未明確。2型囊泡單胺轉(zhuǎn)運體(vesicular monoamine transporter 2， VMAT2)靶點正電子探針可用于評估多巴胺能神經(jīng)元功能[5]。本研究應(yīng)用VMAT2靶點分子探針18F-FP-(+)-DTBZ對2型DM(type 2 DM， T2DM)大鼠行PET/CT顯像，觀察T2DM對腦多巴胺能神經(jīng)元的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 12只Zucker Diabetic Fatty(ZDF)雄性大鼠，SPF級，8周齡，體質(zhì)量200～300 g，購自北京維通利華有限責(zé)任公司，許可證編號：SCXK(京)2016-0006，分為T2DM組(基因型fa/fa)和對照組(基因型fa/+)，每組6只。

1.2 建立T2DM模型 大鼠飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)實驗動物中心清潔級動物房，室溫21oC，相對濕度50%，光照明暗周期12 h，分籠喂養(yǎng)，自由采食與飲水。予T2DM組高脂飼料飼養(yǎng)，對照組普通維持飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)2周后經(jīng)尾靜脈取血，以Roche血糖儀測量T2DM組大鼠隨機血糖，連續(xù)2次隨機血糖≥11.1 mmol/L提示建模成功。

1.3 儀器與方法 采用Siemens Inveon Micro-PET/CT掃描儀，掃描參數(shù)：PET有效橫向FOV 10 cm，軸向FOV 12.7 cm，空間分辨率1.4 mm，管電壓80 kV，管電流500 μA。放射性示蹤劑18F-FP-(+)-DTBZ由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院PET中心自主制備，符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范[6]，放射化學(xué)純度>99%，內(nèi)毒素小于0.5 IU/25 mg；其他質(zhì)量控制參數(shù)均符合要求，適用于活體注射[7]。于大鼠3、6和12月齡時測量其體質(zhì)量及空腹血糖；于麻醉箱內(nèi)以異氟烷與氧氣混合氣體(3∶1)誘導(dǎo)麻醉，成功后將大鼠以仰臥位保定于掃描床上，以異氟烷與氧氣混合氣體(2∶1)維持麻醉，觀察無異常反應(yīng)后，經(jīng)尾靜脈注射顯像劑10 μCi/g。 60 min后行3D模式腦部顯像10 min，采用同機CT衰減矯正。于Inveon工作站采用OSEM 3D方式重建圖像，迭代次數(shù)2，分辨率1.5 mm，Zoom為1，矩陣為128×128。

1.4 圖像分析 采用PMOD 4.0圖像分析軟件，基于軟件地圖集進行圖像融合，共獲得58個ROI，包括紋狀體、小腦、杏仁核、海馬體、下丘腦、嗅球及丘腦等。根據(jù)紋狀體區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)攝取值(standardized uptake value， SUV)值與小腦SUV比值計算紋狀體標(biāo)準(zhǔn)攝取比值(standardized uptake value ratio， SUVR)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Prism 8統(tǒng)計學(xué)分析軟件。計量資料用±s表示，以雙因素方差分析比較2組大鼠各時間點體質(zhì)量、空腹血糖、紋狀體SUVR及組內(nèi)各時間點血糖。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量及血糖水平 2組大鼠3～12月齡體質(zhì)量均有所增長；6月齡時T2DM組體質(zhì)量明顯高于對照組(P<0.05)，而3月及12月齡時差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。組間比較，T2DM組大鼠第6個月和12個月空腹血糖均明顯高于對照組(P均<0.05)；第3個月差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對照組大鼠空腹血糖較穩(wěn)定，各時間點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。組內(nèi)比較，T2DM組大鼠3～12月齡空腹血糖逐漸增高，12月齡時達最高水平，明顯高于3月(P<0.01)及6月齡時(P<0.05)，其余時間點組內(nèi)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。

2.2 紋狀體SUVR T2DM組大3和6月齡時腦紋狀體SUVR與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，12月齡時明顯低于對照組(P<0.05)；12月齡時的SUVR明顯低于6月齡(P<0.01)，6和12月齡時SUVR均高于3月齡時(P均<0.05)。對照組大鼠6和12月齡時腦紋狀體SUVR均明顯高于3月齡時(P均<0.05)，6與12月齡時差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1及表2。

3 討論

既往研究[3，8]發(fā)現(xiàn)多種降糖藥物治療PD均有較好效果，T2DM與PD之間存在較多相同病理生理學(xué)機制，如線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、維生素D減少及泛素-蛋白酶和自噬-溶酶體系統(tǒng)功能異常等。DM是PD發(fā)病的獨立危險因素[9-10]，但具體作用機制尚未明確。

表1 2組大鼠各時間點體質(zhì)量及血糖水平比較(±s)

表1 2組大鼠各時間點體質(zhì)量及血糖水平比較(±s)

注：*：與3月齡時血糖水平比較，P<0.01；#：與6月齡時血糖水平比較，P<0.05

組別體質(zhì)量(g)3月齡6月齡12月齡血糖(mmol/L)3月齡6月齡12月齡T2DM組(n=6)267.20±9.42454.33±55.88402.33±19.457.98±2.1710.58±3.0015.63±5.85*#對照組(n=6)202.00±5.70380.17±18.84442.67±87.523.88±1.375.95±0.755.40±0.49t值2.262.821.532.483.076.05P值0.090.030.360.060.01<0.01

圖1 2組大鼠腦18F-FP-(+)-DTBZ PET圖 6月齡時紋狀體SUVR最高，12月齡時紋狀體SUVR低于6月齡而高于3月齡時

表2 2組大鼠各時間點紋狀體SUVR比較(±s，n=6)

表2 2組大鼠各時間點紋狀體SUVR比較(±s，n=6)

注：*：與3月齡時比較，P<0.05；#：與6月齡時比較，P<0.01

組別3月齡6月齡12月齡T2DM組2.20±0.323.18±0.21*2.68±0.24*#對照組2.49±0.223.51±0.28*3.46±0.23*t值1.462.335.44P值0.400.08<0.01

PD是由黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元丟失引起的神經(jīng)退行性疾病。目前針對PD的正電子分子探針主要包括以多巴胺轉(zhuǎn)運體(dopamine transporter， DAT)、反映多巴脫羧酶活性、突觸囊泡上VMAT2及多巴胺受體D1和D2為靶點的各種顯像劑。本研究以VMAT2靶點分子探針18F-FP-(+)-DTBZ對T2DM大鼠行PET/CT顯像，旨在觀察T2DM對腦多巴胺能神經(jīng)元的影響。VMAT2主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多巴胺能、去甲腎上腺素能及5-羥色胺能等神經(jīng)元突觸末梢內(nèi)，是位于突觸囊泡膜上的轉(zhuǎn)運蛋白，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運多巴胺至囊泡內(nèi)。相關(guān)研究[11]證實，黑質(zhì)-紋狀體投射通路中，90%以上VMAT2陽性神經(jīng)纖維屬于多巴胺能。VMAT2是中樞內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的重要載體，可反映多巴胺能神經(jīng)元功能。PETRISIC等[12]發(fā)現(xiàn)DM動物模型腦內(nèi)DAT表達水平明顯下降。胰島素功能與DAT和酪氨酸羥化酶的水平密切相關(guān)，胰島素通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B， PI3k/AKT)通路調(diào)節(jié)DAT水平，胰島素缺乏可致DAT功能障礙[13-15]。本研究中12月齡時T2DM組紋狀體SUVR明顯低于對照組(P<0.05)，提示高血糖可下調(diào)腦紋狀體VMAT2表達，引起多巴胺能神經(jīng)元功能異常。

本研究所用ZDF大鼠為目前制備T2DM模型時應(yīng)用較多的動物。研究[16]表明，雄性ZDF大鼠7周齡前表現(xiàn)為進行性肥胖、高脂血癥及胰島素抵抗，此階段其胰島β細(xì)胞數(shù)量約為對照組的2倍，功能已出現(xiàn)異常；8周齡后胰島β細(xì)胞數(shù)量逐漸減低，胰島形態(tài)高度混亂，伴明顯纖維化，空腹血糖隨血漿胰島素水平降低而逐漸升高；其體質(zhì)量增長速度降低與血漿胰島素減少和空腹高血糖升高時間相符合[17]。本研究T2DM組大鼠體質(zhì)量于6月齡時達到最高，之后逐漸降低；3～12月齡空腹血糖呈逐漸上升趨勢，與既往報道基本一致。

本研究中，T2DM組大鼠12月齡時紋狀體SUVR明顯低于對照組(P<0.05)，6月齡時較對照組呈下降趨勢，結(jié)合同期2組血糖水平，提示血糖增高可不同程度降低腦內(nèi)VMAT2表達水平；T2DM組大鼠12月齡時紋狀體18F-FP-(+)-DTBZ攝取較6月齡時明顯下降(P<0.05)，此時對照組大鼠僅輕度減低(P>0.05)，提示T2DM可能加劇腦VMAT2表達降低。CEREDA等[18]發(fā)現(xiàn)，確診PD前已罹患T2DM者運動癥狀損害較未合并T2DM的PD患者更為嚴(yán)重，且需要更大劑量左旋多巴藥物治療，本研究結(jié)果與其相符。2組大鼠6和12月齡時紋狀體18F-FP-(+)-DTBZ攝取均較3月齡時明顯增高(P均<0.05)，可能與大鼠腦發(fā)育相關(guān)[7]。

T2DM引起腦內(nèi)VMAT2表達降低的可能原因如下：①胰島素抵抗或胰島素缺乏導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)功能異常。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)黑質(zhì)與多巴胺能神經(jīng)元存在較多的胰島素受體，且胰島素可透過血腦屏障，二者結(jié)合可使胰島素受體底物磷酸化，激活下游PI3k/AKT等通路。腦內(nèi)出現(xiàn)胰島素抵抗可能與外周胰島素水平增加導(dǎo)致其腦內(nèi)水平增高、進而使胰島素受體底物表達下調(diào)及下游信號通路受損相關(guān)。胰島素可調(diào)控多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)mRNA的表達，故腦內(nèi)胰島素缺乏也可引起多巴胺能神經(jīng)功能異常。MORRIS等[19]發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高脂肪飲食喂養(yǎng)的胰島素抵抗大鼠多巴胺釋放減弱、清除率降低，提示胰島素抵抗可損害黑質(zhì)紋狀體多巴胺功能。②高血糖導(dǎo)致的多巴胺能神經(jīng)損傷。正常情況下葡萄糖是腦組織唯一能量來源，能量代謝障礙可致腦功能受損。XIE等[20]觀察高血糖狀態(tài)下多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)高血糖引起的丙酮醛增高可損傷多巴胺能神經(jīng)元，丙酮醛可與多巴胺反應(yīng)，產(chǎn)生1-乙酰基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉(1-acetyl-6,7-dihydroxyl-1,2,3,4-Tetrahydroisoquinoline， ADTIQ)，誘導(dǎo)多巴胺能細(xì)胞中的線粒體凋亡[21]。

綜上所述，T2DM可降低大鼠腦內(nèi)多巴胺能通路中VMAT2的表達，提示糖尿病對腦多巴胺能神經(jīng)功能存在影響，為進一步研究T2DM和PD關(guān)聯(lián)機制提供了新的實驗依據(jù)。