綠僵菌與3種殺蟲劑混配對樟巢螟的協同作用

楊 華，趙丹陽，秦長生*

(1. 華南農業大學農學院，廣州 510640；2. 廣東省林業科學研究院/廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣州510520)

樟巢螟Orthagaachatin又稱樟叢螟、樟葉瘤叢螟，屬鱗翅目Lepidoptera螟蛾科Pyrdidae瘤叢螟屬Orthaga，主要危害樟科Lauraceae植物，在廣東省韶關市、肇慶市以及潮州市等多地造成嚴重危害(邱華龍等, 2016)。該蟲以幼蟲危害寄主植物葉片，1～2齡幼蟲啃食葉片，2～3齡后開始吐絲結巢，將小樹枝和葉片粘粘在一起，連同蟲糞卷結在一起形成10～20 cm大小不等的鳥巢狀的蟲苞，在蟲苞內取食嫩枝和嫩葉，發生嚴重時，整株葉片均可以被吃光，嚴重影響樟樹的生長及美觀(魏書軍等, 2008; 趙丹陽等, 2016)。

目前對樟巢螟防治主要依賴于化學防治(張念環等, 2005; 楊曉娟等, 2006)，但化學防治會產生相應的“3R”問題。而綠僵菌、白僵菌等昆蟲病原真菌可以主動侵入寄主體壁，分泌毒素致死寄主(徐金柱等, 2017)，并在體內迅速繁殖，使其發病迅猛，可在短期內有效遏制多種農林害蟲種群數量增長；還能在寄主缺乏的情況下宿存于土壤中，在適宜條件下能隨蟲口的增加而大量繁殖，與害蟲的發生保持較好的一致性，能起到對害蟲持續控制的作用(Yangetal., 2019)。

本項目選用3株綠僵菌(Ma09、3297和Mf985)、1株白僵菌(GDLY9)及3種高效低毒殺蟲劑(苯氧威、除蟲脲和短穩桿菌)對樟巢螟低齡幼蟲進行了毒力測定，并測定了金龜子綠僵菌Ma09和3種殺蟲劑混配對樟巢螟低齡幼蟲的協同作用，以期篩選出更為安全、低毒、高效的樟巢螟防治藥劑，為樟巢螟的防治提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

供試菌株：蚱蜢綠僵菌Mf985、金龜子綠僵菌Ma09、金龜子綠僵菌3297及球孢白僵菌GDLY9。菌株由廣東省森林培育與保護利用重點實驗室保存，綠僵菌孢子粉含孢量約為3×109孢子/g，白僵菌含孢量約為5×109孢子/g，含水量小于5%。

供試藥劑：苯氧威(3%乳油，河南省鄭州市沙隆達偉新農藥有限公司)、除蟲脲(20%懸浮劑，河南省安陽市安林生物化工責任有限公司)、短穩桿菌Empedobacterbrevis(100億孢子/ml懸浮劑，鎮江市潤宇生物科技開發有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1綠僵菌、白僵菌以及3 種殺蟲劑對樟巢螟低齡幼蟲的毒力

從林間采集樟巢螟蟲苞帶回實驗室，用細毛筆挑取健康活潑的2～3齡幼蟲作為供試昆蟲。將幼蟲置于15 cm培養皿中，底部鋪有濾紙，以新鮮樟樹葉片飼喂。分別將綠僵菌、白僵菌和3種殺蟲劑配制成一定濃度的藥液并按梯度進行稀釋，采用Potter塔噴霧法，將裝有幼蟲的培養皿置于噴霧塔的載物臺上，每次噴1 mL藥劑到蟲體上，將幼蟲用細毛筆挑取后轉移至養蟲盒中飼養觀察，統計每日死亡數。每個處理30頭，3次重復，以0.1%吐溫-80溶液為對照。

1.2.2綠僵菌與3種殺蟲劑混配對樟巢螟低齡幼蟲的毒力

選擇金龜子綠僵菌Ma09分別與苯氧威、除蟲脲和短穩桿菌進行混配并測定其協同增效作用。綠僵菌孢懸液配制成1×106孢子/mL的濃度，加入殺蟲劑，使殺蟲劑稀釋濃度達到1 000倍，參照1.2進行樟巢螟低齡幼蟲的毒力測定。同時分別測定單獨使用綠僵菌和殺蟲劑對低齡樟巢螟幼蟲毒力。根據下列公式計算協同毒力指數(c.i)并將其作為評判兩種藥劑相互作用的依據，當c.i ≥ 20時為判定為增效作用，c.i ≤ -20時為拮抗作用，-20

1.3 數據處理與分析

所得數據用SPSS 20.0統計軟件進行處理分析，采用Duncan氏新復極差測驗進行差異顯著性分析。并運用Probit機率值分析法求出毒力回歸方程、半致死時間LT50、LT90、95%置信區間、卡方值、顯著性等(賈春生, 2006)。

2 結果與分析

2.1 綠僵菌、白僵菌對樟巢螟低齡幼蟲的毒力

不同濃度下，4種昆蟲病原菌處理后，樟巢螟每日死亡情況(圖1)。總體上，死亡高峰期基本在處理后的第3～4天，1×108孢子/mL濃度的孢子懸浮液處理后6 d之內樟巢螟全部死亡。低濃度的孢子懸浮液處理后，死亡持續時間較長，7～8 d之內仍有活蟲，有些處理甚至持續至12 d。白僵菌GDLY9的效果要優于其他3種綠僵菌。基本上所有濃度處理后6 d之內樟巢螟全部死亡。

圖1 樟巢螟在4種昆蟲病原真菌不同濃度下日死亡情況Fig.1 Orthaga achatina larvae daily death of 4 entomopathogenic fungi at different concentrations

表1～表4展示了3種綠僵菌和1種白僵菌對低齡樟巢螟幼蟲的毒力，回歸分析表明，死亡率與時間呈線性相關，并且致死中時相隨著孢子濃度的增大而降低。當孢子濃度達到108孢子/mL這一級別時，4種昆蟲病原菌的致死中時均在3 d左右，分別為3.21、3.5、3.03、3.01 d。當孢子濃度為104孢子/mL這一級別時，4種病原菌的致死中時差異較大，分別為8.48、5.54、5.06和3.89 d，其種白僵菌GDLY9效果最好(LT50為5.06 d)，綠僵菌3297效果最差(LT50為8.48 d)。綠僵菌Mf985和Ma09效果相當，LT50均在5 d左右。

2.2 3種化學藥劑對樟巢螟的毒力

處理24 h后，苯氧威和除蟲脲的致死中濃度LC50分別為35.89和129.42 μg/mL，苯氧威的效果顯著優于除蟲脲；同樣處理48 h后，苯氧威的LC50為13.67 μg/mL，LC90為35.53 μg/mL，均顯著低于除蟲脲(LC50為82.53 μg/mL，LC90為158.38 μg/mL)，說明苯氧威對樟巢螟低齡幼蟲的防治效果要優于除蟲脲(表5)。短穩桿菌對樟巢螟低齡幼蟲也表現出了良好的致死作用(表6)，1×108孢子/mL濃度處理后的LT50和LT90分別為1.28、2.50 d，并且各個濃度在處理5 d后，死亡率均達到了100%。

表1 綠僵菌Mf985對樟巢螟幼蟲的毒力

表2 綠僵菌Ma09對樟巢螟幼蟲的毒力

表3 綠僵菌3297對樟巢螟幼蟲的毒力

表4 白僵菌GDLY9對樟巢螟幼蟲的毒力

表5 苯氧威和除蟲脲對樟巢螟幼蟲的毒力

表6 短穩桿菌對樟巢螟幼蟲的毒力

2.3 綠僵菌與3種化學藥劑混配對樟巢螟低齡幼蟲的毒力

協同作用結果(表7)表明，混配劑中，綠僵菌Ma09與3種殺蟲劑混配對樟巢螟2～3齡幼蟲致死效果均比較好，混配后其校正死亡率分別為100%、85.78%和87.56%，綠僵菌與3種藥劑混配后協同指數分別為20.43、27.52和33.13，均大于20，表現出增效作用，并且綠僵菌與苯氧威混配后對低齡樟巢螟幼蟲的致死率達到了100%，防治效果明顯。

表7 綠僵菌Ma09與3種殺蟲劑混配對樟巢螟幼蟲的增效作用

3 討論與結論

綠僵菌能通過主動侵染寄主、穿透昆蟲體壁致死寄主，其發病迅猛，可在短期內有效遏制害蟲種群數量的急劇增加，將害蟲控制在經濟損害水平以下。據童應華等(2014)報道，綠僵菌Ma1291-2對樟巢螟具有較強的致病力，以點滴法將1.0×108孢子/mL的孢子懸液接到2～3齡幼蟲的體表，LT50為6.29 d。本實驗選用的幾種昆蟲病原菌對樟巢螟低齡幼蟲均具有較強的致病力，1.0×108孢子/mL濃度處理的LT50在3～4 d之間。生物測定中不同的接種方式導致毒力測定結果差異較大，有時甚至無法比較(Wraightetal., 1998)。規范的生物測定方法要求真菌制劑的接種方式盡可能模擬自然侵染，利于田間應用，因此最好采用噴霧或者噴粉方式進行。此外不同的菌株之間毒力差異也比較大，大量的關于綠僵菌菌株篩選的研究表明 (臧歡等, 2013; 于浩海等, 2014; 劉晨等, 2014; 練濤等, 2019; 鄧嘉茹等, 2020)，雖然不同的菌株對不同寄主顯示出了顯著的致病性差異，但篩選出的高致病力菌株的LT50都在2～8 d，利用綠僵菌、白僵菌等開展農林害蟲的防治，菌株之間的差異具有較大利用空間，因此針對不同寄主進行菌株篩選是十分必要的。

細菌殺蟲劑是另一種可利用的生物殺蟲劑，劉樹生(劉樹生, 2009)利用8 000 IU/mg蘇云金桿菌可濕性粉劑防治樟巢螟，7 d后防治效果達到92.28%，持效期長。關麗梅(關麗梅等, 2018)等人分離出來一株對樟巢螟具有較高毒力的致病性粘質沙雷氏菌(LS-1)，樟巢螟感染該菌后蟲體發紅、發黑，變軟，部分甚至流出膿液，感染120 h后，校正死亡率為69.1%，說明該菌株對樟巢螟具有很強的致死作用。本實驗中所使用的短穩桿菌是一種革蘭氏陰性菌，源自田間自然感病的斜紋葉蛾Spodopteralitura幼蟲(王以一等, 2014)，是多種鱗翅目害蟲的重要細菌性致病菌(楊延芳等, 2016; 王義生等, 2018; 王迎春等, 2019)經大規模發酵而獲得的產品，已在國內外多個地區進行了推廣應用。本研究表明該菌對樟巢螟2～3齡幼蟲也具有較高的致死性。各個濃度下致死中時在1～3 d，并且5 d后全部死亡。

昆蟲生長調節劑針對昆蟲特定生長時期，具有高度的選擇性，對人和動物都是安全的，并且與傳統殺蟲劑機理不同，可以有效緩解因長時間大量使用傳統殺蟲劑帶來的抗藥性問題(何佳和蔣志勝, 2003)。苯氧威是一種非萜烯類氨基甲酸酯類化合物，具有胃毒和觸殺作用，并對多種昆蟲有保幼激素活性，可抑制幼蟲蛻皮，無法發育成成蟲(孫德瑩等, 2006)。除蟲脲是第1個苯甲酰苯脲類選擇性殺蟲劑，具有觸殺和胃毒作用，是另一種昆蟲生長調節劑類殺蟲劑(Yaoetal., 2020)。二者雖然都在蛻皮過程中發揮作用，但是作用機制完全不同。苯氧威是一種非甾體保幼激素類似物，主要作用是阻止昆蟲發育、抑制變態發生；而除蟲脲屬于幾丁質合成抑制劑，可使昆蟲表皮的幾丁質合成過程受阻，沉積受抑制。也正是因為二者的作用機制不同，將其與綠僵菌混配后獲得的作用效果亦不同(c.i苯氧威=20.43；c.i除蟲脲=27.52)。綠僵菌分泌大量表皮降解酶降解體壁，打通侵入通道，從而成功侵入。而除蟲脲恰恰抑制了昆蟲體壁主要成分幾丁質的合成，從而使得綠僵菌更加容易侵染，因此將綠僵菌與除蟲脲混用后具有更好的增效作用。使用微生物殺蟲劑和昆蟲病原菌的混合后相比較化學殺蟲劑對環境和天敵的影響更小。一般情況下，化學殺蟲劑及其助劑等往往會對病原菌孢子造成傷害，但是同為生物源的昆蟲病原細菌通常不會對真菌產生影響(Zouetal., 2013)，因此試驗中所選用的綠僵菌與短穩桿菌混配后增效作用最好。

據調查樟巢螟在大部分地區1年發生2代，部分地區存在3代(樊敏等, 2006; 溫小玲和吳希從, 2007)，第1代整齊，第2代有少數出現世代重疊現象，7～8月份幼蟲和成蟲同時出現。因此最佳防治時間應該為第1代幼蟲為害期5～7月份。本實驗所選用的幾種藥劑對樟巢螟2～3齡幼蟲均有較好的致死效果。但是由于樟巢螟不同于其他鱗翅目害蟲，其幼蟲隱藏于蟲苞中，因此林間防治的時候常規的噴霧方法有時候難以滲入蟲苞中，可考慮將綠僵菌與3種殺蟲劑混合其制成微膠囊粉劑，噴粉機噴施粉劑，操作簡單，并且對環境要求低(楊華等, 2018)。大面積的林間生物防治技術的研發是下一步需要解決的問題，因此需要大量培養綠僵菌孢子粉，而本實驗室已經形成了一套完整的金龜子綠僵菌Ma09中試生產工藝，可大量生產綠僵菌孢子粉。但是對于白僵菌還未形成完整的生產工藝。因此在藥劑混配協同作用試驗中選擇金龜子綠僵菌Ma09而沒有選擇效果更好的白僵菌GDLY9。