不同寄主植物繼代飼養(yǎng)后草地貪夜蛾幼蟲(chóng)生理酶活性差異

魯智慧，陳亞平，周叆春，和淑琪，李 浩，包禹優(yōu)，桂富榮，3*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201； 2. 云南省植保植檢站，昆明 650034；3. 云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，昆明 650201)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(J.E.Smith)是鱗翅目夜蛾科灰翅夜蛾屬的一種多食性昆蟲(chóng)，原產(chǎn)于美洲，2019年1月在云南省普洱市江城縣首次發(fā)現(xiàn)其危害，2019年10月已在我國(guó)26個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)的1 518個(gè)縣(區(qū)、市)分布，見(jiàn)蟲(chóng)面積100多萬(wàn)hm2(姜玉英等, 2019; 王磊等, 2019a)，2020年呈現(xiàn)出類(lèi)似的擴(kuò)張動(dòng)態(tài)(王磊等, 2020)，對(duì)我國(guó)糧食安全構(gòu)成重大威脅。

草地貪夜蛾寄主種類(lèi)繁多，有包括禾本科、菊科、豆科等76科353種寄主植物(Montezanoetal., 2018; 王磊等, 2019b)。研究表明寄主植物能夠影響昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖力，如取食小麥的草地貪夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育速度較取食玉米的快(呂亮等, 2020)。以玉米、水稻、甘蔗飼喂草地貪夜蛾后，取食玉米的幼蟲(chóng)發(fā)育歷期最短，取食水稻的最長(zhǎng)，而取食玉米時(shí)其低齡幼蟲(chóng)存活率最高，蛹重也顯著大于取食甘蔗和水稻的幼蟲(chóng)(吳正偉等, 2019)。此外，寄主植物還能對(duì)草地貪夜蛾體內(nèi)的生理代謝酶活性產(chǎn)生影響。王芹芹等(2020)研究表明，飼喂小麥48 h后草地貪夜蛾體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性和多功能氧化酶活性較取食玉米的顯著上升。類(lèi)似的研究結(jié)果也存在于其他一些鱗翅目幼蟲(chóng)中，例如美國(guó)白蛾Hyphantriacunea取食類(lèi)黃酮含量最高的西府海棠時(shí)GSTs活性最低，但CarEs和P450酶活性最高，取食總酚含量最高的臭椿后CarEs和GSTs活性均較低，由此說(shuō)明取食次生物質(zhì)含量不同的寄主植物后可誘導(dǎo)美國(guó)白蛾一系列酶系活性的變化(李路莎等, 2018)。事實(shí)上，植物體內(nèi)化學(xué)成分尤其是次生物質(zhì)含量變化可以誘導(dǎo)植食性昆蟲(chóng)的生理特性發(fā)生變化，植物利用次生代謝物質(zhì)對(duì)昆蟲(chóng)進(jìn)行脅迫，從而影響植食性昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，而昆蟲(chóng)則通過(guò)改變體內(nèi)酶的活性以響應(yīng)植物的脅迫作用，減少寄主植物次生物質(zhì)對(duì)機(jī)體的危害(Sahaetal., 2012)。

草地貪夜蛾寄主范圍廣泛，探究寄主植物次生物質(zhì)含量差異對(duì)該蟲(chóng)酶活性的影響，明確其對(duì)寄主植物的長(zhǎng)期選擇適應(yīng)可塑性機(jī)制對(duì)科學(xué)防控該蟲(chóng)及保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全具有重要意義。本研究以3大主要糧食作物(玉米、小麥、馬鈴薯)的葉片連續(xù)飼喂草地貪夜蛾3代后，比較其5齡幼蟲(chóng)體內(nèi)消化酶、保護(hù)酶及解毒酶活性的差異，并分析了這3類(lèi)酶活性與寄主植物葉片次生物質(zhì)含量的關(guān)系，以明確不同寄主植物繼代飼喂對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)代謝酶活性及其生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為進(jìn)一步探究草地貪夜蛾的寄主選擇適應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試蟲(chóng)源

草地貪夜蛾于2019年5月采自云南省玉溪市元江縣(101°58′E, 23°35′N(xiāo), 海拔421 m)，在人工氣候箱(MG-300A, 上海一恒科學(xué)儀器有限公司)內(nèi)飼養(yǎng)10代以上(溫度27±0.5℃, RH 70%±5%, 光周期L ∶D=16 h ∶8 h)。成蟲(chóng)羽化后，以雌 ∶雄=1 ∶1配對(duì)，取同一雌蟲(chóng)產(chǎn)下的卵用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2供試寄主植物

選擇受草地貪夜蛾危害較嚴(yán)重的兩種禾本科糧食作物：玉米ZeamaysL.(品種：中農(nóng)甜488)和小麥TriticumaestivumL.(品種：華高55)以及云南山區(qū)主要糧食作物馬鈴薯SolanumtuberosumL.(品種：云南傳統(tǒng)品種黃皮黃心馬鈴薯)。

購(gòu)買(mǎi)上述寄主植物種子，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用花盆種植，所用土壤在種植前用壓力蒸汽滅菌鍋(型號(hào)：LT-CPS, 立德泰勀科學(xué)儀器有限公司)進(jìn)行滅菌消毒處理。將所有寄主植物置于1.6 m×0.9 m×1.1 m的籠子中(300目紗網(wǎng)覆蓋)栽培，常規(guī)管理，在生長(zhǎng)期間不施用任何化肥和農(nóng)藥，每2 d隨機(jī)更換花盆位置。待玉米發(fā)育至6葉期、小麥株高10 cm、馬鈴薯株高30 cm時(shí)采集葉片飼喂草地貪夜蛾幼蟲(chóng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試蟲(chóng)飼養(yǎng)

試蟲(chóng)飼養(yǎng)及發(fā)育歷期觀(guān)察參照趙文杰等(2019)的方法并稍作改進(jìn)。

1.2.2草地貪夜蛾體內(nèi)酶活測(cè)定

酶活測(cè)定及樣本處理方法參照魯智慧(2020)等的方法并稍做改進(jìn)。試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所、上海優(yōu)選生物科技有限公司。按照說(shuō)明書(shū)所述應(yīng)用該試劑盒分別測(cè)定并計(jì)算出飼喂不同寄主植物至5齡的F3代草地貪夜蛾體內(nèi)消化酶(胃蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶)、保護(hù)酶(過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶)、及解毒酶(谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶、細(xì)胞色素P450s)的活性。每個(gè)酶活性測(cè)定取4個(gè)樣本，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.2.3寄主植物次生物質(zhì)含量測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所和上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司的試劑盒。收集試驗(yàn)1.2.1中用于飼喂草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的3種寄主植物葉片，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定并計(jì)算葉片內(nèi)的次生代謝物質(zhì)(總酚、單寧、類(lèi)黃酮、生物堿)含量。每種植物設(shè)4個(gè)樣本，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

3種寄主植物飼養(yǎng)的F3代草地貪夜蛾5齡幼蟲(chóng)各酶活和寄主植物次生代謝物、幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育歷期數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析均采用Excel 2019和SPSS 22.0軟件進(jìn)行處理。應(yīng)用單因素(One-way ANOVA)檢驗(yàn)，采用Duncan’s新復(fù)極差法(P=0.05)對(duì)比數(shù)據(jù)間的差異顯著性，用Pearson線(xiàn)性相關(guān)性分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)間相關(guān)性分析(P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 取食不同寄主植物后F3代草地貪夜蛾幼蟲(chóng)發(fā)育歷期

以不同寄主植物飼養(yǎng)的F3代草地貪夜蛾幼蟲(chóng)歷期存在差異(表1)。取食馬鈴薯葉片的1～2齡幼蟲(chóng)歷期均長(zhǎng)于取食另外兩種寄主，且在2齡時(shí)差異顯著(P<0.05)；玉米葉上3～5齡幼蟲(chóng)歷期均長(zhǎng)于小麥和馬鈴薯上，尤其以3齡幼蟲(chóng)差異顯著(P<0.05)；進(jìn)入6齡后，玉米上幼蟲(chóng)歷期顯著縮短，僅為3.2 d，而取食小麥和馬鈴薯的均在4.35 d以上。就整個(gè)幼蟲(chóng)發(fā)育歷期來(lái)看，取食馬鈴薯和玉米的較長(zhǎng)，分別為17.6 d、16.9 d；而小麥上的較短，為12.8 d。

2.2 3種寄主植物葉片次生代謝物含量

3種寄主植物葉片中單寧(圖1-A)和類(lèi)黃酮(圖1-C)含量均存在顯著性差異(P<0.05)。其中馬鈴薯葉片中單寧含量(42.83 mg/g)顯著高于玉米(28.80 mg/g)和小麥(17.12 mg/g)。玉米葉中類(lèi)黃酮含量達(dá)1.86 mg/g，為馬鈴薯葉中的1.75倍(P<0.05)，小麥葉片中的類(lèi)黃酮含量更低，僅為0.49 mg/g。小麥中的總酚含量(8.20 μmol/g)顯著低于玉米(15.62 μmol/g)和馬鈴薯葉片(13.91 μmol/g)(圖1-B,P<0.05)；玉米與馬鈴薯葉片中的生物堿含量分別為213.39 ng/mL和221.77 ng/mL，差異不顯著(圖1-D)，但顯著高于小麥(95.27 ng/mL)(P<0.05)。

表1 取食不同寄主植物后草地貪夜蛾F3代幼蟲(chóng)發(fā)育歷期(d)

圖1 3種寄主植物葉片中各類(lèi)次生代謝物質(zhì)含量Fig.1 Contents of secondary metabolites in leaves of three host plants注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同圖中數(shù)據(jù)后具相同小寫(xiě)字母表示葉片內(nèi)次生代謝物質(zhì)含量差異不顯著(P<0.05)。Note: Data in table are mean±SE, and same lowercase letters in the same figure indicate no significant difference in host plant secondary metabolites (P<0.05).

2.3 取食不同寄主植物對(duì)草地貪夜蛾F3代體內(nèi)保護(hù)酶、消化酶及解毒酶活性的影響

取食玉米、小麥、馬鈴薯葉片至F3代時(shí)，草地貪夜蛾體內(nèi)酶活性變化情況如表2所示。草地貪夜蛾幼蟲(chóng)CAT、POD、SOD活性均為取食馬鈴薯葉片的最高，取食玉米葉片的次之，取食小麥葉片的最低。5齡幼蟲(chóng)體內(nèi)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性差異不顯著，但過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性存在顯著性差異(P<0.05)，其中取食馬鈴薯葉片的草地貪夜蛾體內(nèi)POD和SOD活性分別達(dá)48.070 U/mg.prot和6.878 U/mg.prot，而取食小麥的幼蟲(chóng)體內(nèi)POD和SOD活性?xún)H為35.908 U/mg. prot和5.434 U/mg. prot。取食不同寄主植物的F3代草地貪夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)α-淀粉酶和脂肪酶活性均無(wú)顯著性變化，但胃蛋白酶活性變化明顯(P<0.05)，其中以馬鈴薯葉片為食的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)胃蛋白酶活性顯著升高，達(dá)10.502 U/mg.prot，分別為取食玉米葉片(1.508 U/mg.prot)、小麥葉片(3.926 U/mg.prot)幼蟲(chóng)的6.96倍、2.67倍。

上述3種寄主喂食3代后草地貪夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450s(CYP450s)活性產(chǎn)生了顯著變化(P<0.05)，其中，取食玉米葉片上的幼蟲(chóng)CYP450s活性顯著高于取食小麥和馬鈴薯，為8.995 ng/mL，最低的是取食小麥的(7.069 ng/mL)。F3代幼蟲(chóng)谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和羧酸酯酶(CarEs)活性無(wú)顯著性差異。

表2 取食不同寄主植物的草地貪夜蛾F3代保護(hù)酶、消化酶及解毒酶活性

2.4 草地貪夜蛾酶活性與寄主植物葉片內(nèi)次生代謝物含量間關(guān)系

皮爾森線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)分析(表3)表明，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性與總酚、單寧含量呈正相關(guān)關(guān)系，與類(lèi)黃酮、生物堿含量為負(fù)相關(guān)關(guān)系。超氧化物歧化酶(SOD)及脂肪酶的活性與總酚、單寧含量間均為負(fù)相關(guān)，而與類(lèi)黃酮及生物堿間的關(guān)系均為正相關(guān)，其中SOD與生物堿含量間的正相關(guān)關(guān)系顯著(r(SOD，生物堿)=0.550)。4種次生物質(zhì)含量與過(guò)氧化物酶(POD)活性間均為正相關(guān)關(guān)系，而與谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GSTs)間的關(guān)系則均為負(fù)相關(guān)。消化酶中的α-淀粉酶活性與單寧含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與其余3種次生物質(zhì)含量間均為正相關(guān)。除類(lèi)黃酮外，草地貪夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)胃蛋白酶活性與其余植物次生代謝物質(zhì)含量間均有一定的正相關(guān)關(guān)系；草地貪夜蛾的3種解毒酶中，僅羧酸酯酶(CarEs)活性與寄主植物單寧含量間有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r(CarEs，單寧)=-0.549)，而細(xì)胞色素P450s(CYP450s)與寄主植物總酚、單寧、類(lèi)黃酮有正相關(guān)關(guān)系，與生物堿含量間有負(fù)相關(guān)關(guān)系。

表3 草地貪夜蛾體內(nèi)酶活性與寄主植物次生代謝物質(zhì)含量間的皮爾森線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)

3 結(jié)論與討論

次生物質(zhì)是植物抵御植食性昆蟲(chóng)為害的主要化學(xué)物質(zhì)，昆蟲(chóng)進(jìn)食時(shí)這些物質(zhì)連同植物組織一起進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)，可對(duì)昆蟲(chóng)的機(jī)體產(chǎn)生脅迫作用，破壞昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的自由基代謝平衡，影響昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，因此植食性昆蟲(chóng)通過(guò)一系列的防御行為，如改變體內(nèi)生理酶的活性，來(lái)減少次生物質(zhì)的脅迫作用(Piskorskietal., 2011)。昆蟲(chóng)體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)能夠催化超氧離子自由基歧化，過(guò)氧化物酶(POD)能清除動(dòng)植物體內(nèi)的過(guò)氧化氫和毒性物質(zhì)并參與活性氧的代謝，過(guò)氧化氫酶(CAT)能將過(guò)量的H2O2催化為水和氧氣，對(duì)生物體起到保護(hù)作用(Zámockyetal., 1999; 董亮等, 2013)。在前期研究中，筆者發(fā)現(xiàn)以總酚、單寧、類(lèi)黃酮含量均較高的馬鈴薯葉片飼喂F1代草地貪夜蛾幼蟲(chóng)后，其體內(nèi)POD、SOD和CAT活性均顯著升高(魯智慧等, 2020)，而連續(xù)飼喂至F3代時(shí)以高次生物質(zhì)(總酚、單寧、類(lèi)黃酮和生物堿)含量的葉片(馬鈴薯、玉米)為食的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)3種保護(hù)酶活性依然高于取食較低次生物質(zhì)含量的寄主植物(小麥)的幼蟲(chóng)，且以玉米、馬鈴薯為食的幼蟲(chóng)總發(fā)育歷期顯著長(zhǎng)于以小麥為食的幼蟲(chóng)，說(shuō)明次生物質(zhì)含量高的寄主植物對(duì)草地貪夜蛾保護(hù)酶活性有激活作用，同時(shí)會(huì)使幼蟲(chóng)發(fā)育歷期延長(zhǎng)。但幼蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶活性低、發(fā)育歷期短并不意味著小麥?zhǔn)遣莸刎澮苟甑淖钸m寄主植物。呂亮等(2020)研究表明，草地貪夜蛾取食小麥時(shí)，生長(zhǎng)發(fā)育速度較取食玉米的快，但其食物利用效率、種群繁殖能力等均低于取食玉米。巴吐西等(2019)也發(fā)現(xiàn)取食小麥后草地貪夜蛾幼蟲(chóng)存活率、化蛹率、羽化率和世代存活率也均低于取食玉米，因此，取食玉米最有利于草地貪夜蛾的生存和繁衍。用馬鈴薯、玉米和小麥繼代飼養(yǎng)后，F(xiàn)1代與F3代草地貪夜蛾幼蟲(chóng)胃蛋白酶活性均表現(xiàn)為玉米<小麥<馬鈴薯。蛋白酶能將食物中的蛋白質(zhì)水解為氨基酸，為昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)和繁殖提供氮源，因此取食小麥和馬鈴薯后，幼蟲(chóng)體內(nèi)的胃蛋白酶活性升高可能是草地貪夜蛾對(duì)非最適寄主植物適應(yīng)可塑性發(fā)揮作用的結(jié)果。

雜食性昆蟲(chóng)對(duì)植物次生代謝物質(zhì)起分解代謝作用的酶主要有谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarEs)和細(xì)胞色素P450s(CYP450s)等，這些酶的活性會(huì)隨著所取食寄主植物的不同而發(fā)生變化(Desprésetal., 2007)，如取食含次生物質(zhì)含量低的寄主后亞洲小車(chē)蝗Oedaleusasiaticus的解毒酶(CYP450s, CarEs, GSTs)活性低(Huangetal., 2017)。美國(guó)白蛾Hyphantriacunea取食類(lèi)黃酮含量高的寄主后GSTs活性最低，CarEs和P450酶的活性最高，而以總酚含量高的寄主為食后,CarEs和GSTs活性均較低(李路莎等, 2018)。定量攝入肉桂酸和香豆素后斜紋夜蛾Spodopteralitura中腸中CarEs活性分別提高了1.67倍和1.37倍，肪體中P450酶含量比對(duì)照增加了2.93倍和14.50倍(王瑞龍等, 2012)。本研究顯示，以次生物質(zhì)(總酚、單寧、類(lèi)黃酮和生物堿)含量不同的寄主植物繼代飼喂后，草地貪夜蛾F3代幼蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450酶活性變化與各寄主葉片內(nèi)類(lèi)黃酮含量變化趨勢(shì)基本一致，取食類(lèi)黃酮含量最高的玉米后幼蟲(chóng)CYP450s含量也最高，而馬鈴薯葉片內(nèi)類(lèi)黃酮含量雖然也相對(duì)較高，但CYP450s活性并不高，這可能是由于取食該寄主的幼蟲(chóng)體內(nèi)3種保護(hù)酶特別是POD和SOD的活性均較高，從而減輕了類(lèi)黃酮的毒害作用；其余兩種解毒酶CarEs、GSTs活性未發(fā)生顯著性變化，可能是由于草地貪夜蛾對(duì)于不同寄主植物的適應(yīng)可塑性強(qiáng)；經(jīng)過(guò)連續(xù)3代的同一寄主植物取食后草地貪夜蛾已逐步適應(yīng)了這些寄主，且多代持續(xù)保持高解毒酶活性需要大量消耗幼蟲(chóng)為了進(jìn)行其余生命活動(dòng)而儲(chǔ)備的能量(Riveroetal., 2011)，不利于種群繁衍。Gui等(2020)對(duì)草地貪夜蛾的基因組學(xué)分析結(jié)果顯示入侵中國(guó)的草地貪夜蛾細(xì)胞色素P450基因家族與其余鱗翅目昆蟲(chóng)相比顯著擴(kuò)增(達(dá)425個(gè), 為近緣種斜紋夜蛾的3倍左右)，其中有283個(gè)基因?yàn)椴莸刎澮苟晁赜校⑼茰y(cè)這種擴(kuò)增現(xiàn)象可能與草地貪夜蛾的高度雜食性有關(guān)，這些新擴(kuò)增的P450基因家族成員在對(duì)有毒物質(zhì)的代謝及抗藥性的發(fā)展中起到了至關(guān)重要的作用，因此經(jīng)過(guò)多代飼喂后草地貪夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)CarEs和GSTs活性趨于穩(wěn)定，從而將更多能量用于生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖活動(dòng)，僅剩下對(duì)草地貪夜蛾來(lái)說(shuō)解毒功能較強(qiáng)的CYP450s酶系繼續(xù)承擔(dān)對(duì)寄主次生物質(zhì)的代謝作用。

綜上所述，草地貪夜蛾對(duì)不同寄主植物的適應(yīng)可塑性較強(qiáng)，其體內(nèi)各類(lèi)酶可協(xié)同發(fā)揮作用，當(dāng)種群繁衍至F3代時(shí)消化酶中的脂肪酶和α-淀粉酶活性變化減小，僅胃蛋白酶活性保持顯著性變化以便適應(yīng)非最適寄主植物，提高保護(hù)酶活性以減輕寄主次生物質(zhì)對(duì)蟲(chóng)體的大部分危害，剩余的少量有毒物質(zhì)僅由解毒酶中解毒代謝功能較強(qiáng)的CYP450s進(jìn)行分解，以減少對(duì)蟲(chóng)體的能量消耗。通過(guò)各種酶系共同維持幼蟲(chóng)機(jī)體內(nèi)的代謝平衡，從而最大程度減少額外的能量消耗。本研究?jī)H通過(guò)生理酶活性和發(fā)育歷期長(zhǎng)短來(lái)初步探索草地貪夜蛾對(duì)不同寄主植物的適應(yīng)機(jī)制，其中的分子適應(yīng)機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。