草地貪夜蛾半胱氨酸蛋白酶Sf-caspase-3基因克隆與表達(dá)分析

舒本水，鐘宏新，馮 杰，洪一峰，林進(jìn)添

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州市亞熱帶果樹重大疫情控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510225)

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是多細(xì)胞生物體中受基因調(diào)控且自主發(fā)生的一種重要生理過程，其通過一系列的生物學(xué)反應(yīng)消除多余、變異或惡化的細(xì)胞,參與調(diào)控生物體的生長發(fā)育、維持機(jī)體動(dòng)態(tài)平衡及應(yīng)對各種外界刺激(Zhangetal., 2018; Yuanetal., 2020)。天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族是執(zhí)行細(xì)胞凋亡過程的主要酶類，所引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的不同，caspases被分為具有caspase募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domains, CARDs)和死亡執(zhí)行結(jié)構(gòu)域(death effector domains, DEDs)的起始caspases和只有短的原結(jié)構(gòu)域的執(zhí)行caspases(Wangetal., 2018)。迄今為止在線蟲、酵母、昆蟲乃至哺乳動(dòng)物中都發(fā)現(xiàn)多種不同的caspases。它們具有高度保守的QACXG(X為R、Q或G)五肽序列；以半胱氨酸作為裂解底物的親和基團(tuán)催化底物的天冬氨酸羧基端肽鍵斷裂，且對催化底物的天冬氨酸具有特異性(趙瑞杰等, 2010)。黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中鑒定的7個(gè)caspases，包括起始caspases Dronc，Dredd和Strica以及執(zhí)行caspases Drice，Dcp-1，Decay和Damm。一般情況下caspases以無活性的酶原形式存在。一旦接收凋亡信號，Apaf-1同源蛋白Dark在dATP存在下發(fā)生寡聚化形成八聚體凋亡復(fù)合體(Apoptosome)，Dark的CARDs結(jié)構(gòu)域在凋亡復(fù)合體中心形成皇冠狀結(jié)構(gòu)募集Dronc(Yuanetal., 2013)。Dronc形成二聚體后被凋亡復(fù)合體激活，活化的Dronc催化裂解Drice，最終導(dǎo)致caspases級聯(lián)反應(yīng)的放大。活化的Drice裂解細(xì)胞成分，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡(Kangetal., 2017)。

鱗翅目昆蟲中caspases被劃分為caspase-1，-2，-3，-4，-5和-6。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)及與果蠅caspases同源性分析，Lep-caspase-1，-2和-3被推測為執(zhí)行caspases，Lep-caspase-5和-6為起始caspases，而Lep-caspase-4的功能未知(Courtiadeetal., 2011)。目前caspase-3基因已在斜紋夜蛾Spodopteralitura、甜菜夜蛾Spodopteraexigua、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、甘藍(lán)夜蛾Mamestrabrassicae、大蠟螟Galleriamellonella、模毒蛾Lymantriamonacha等多種鱗翅目昆蟲被鑒定，同時(shí)功能也陸續(xù)被揭示。大蠟螟Gm-caspase-3在不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，其中5齡幼蟲表達(dá)量最高。在饑餓狀態(tài)下大蠟螟中腸細(xì)胞發(fā)生凋亡并伴隨著Gm-caspase-3的上調(diào)表達(dá)(Khoaetal., 2012)。來源于藥西瓜Citrulluscolocynthis的凝集素顯著上調(diào)石榴螟EctomyeloisceratoniaeEc-caspase-3表達(dá)量(Ramzietal., 2016)。植物源化合物印楝素上調(diào)斜紋夜蛾S.litura中腸Sl-caspase-3表達(dá)量并誘導(dǎo)斜紋夜蛾中腸細(xì)胞發(fā)生凋亡，推測Sl-caspase-3可能參與印楝素誘導(dǎo)的斜紋夜蛾中腸細(xì)胞凋亡(Shuetal., 2018)。小菜蛾P(guān)lutellaxylostella生殖細(xì)胞中Px-caspase-3顯著上調(diào)表達(dá)應(yīng)對高劑量的60Co-γ輻照脅迫(Lietal., 2019)。

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(Smith)2019年1月入侵我國云南省，是原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)的遷飛性農(nóng)業(yè)重大害蟲，目前已擴(kuò)散至我國大部分地區(qū)(王磊等, 2019; 郭井菲等, 2019)。其雜食性、高繁殖能力、強(qiáng)遠(yuǎn)距離遷飛能力及抗藥性等特點(diǎn)對我國乃至全球糧食生產(chǎn)均造成巨大威脅(吳秋琳等, 2019)。目前在草地貪夜蛾中已鑒定出4種caspases(Sf-caspase-1，-2，-5和-6)，而Sf-caspase-3尚未見報(bào)道(Shuetal., 2017)。本研究以草地貪夜蛾為研究對象，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分析得到Sf-caspase-3基因編碼區(qū)序列。通過PCR對Sf-caspase-3基因編碼區(qū)進(jìn)行克隆及測序，證實(shí)Sf-caspase-3基因序列的準(zhǔn)確性。采用多種生物信息學(xué)軟件對Sf-caspase-3基因進(jìn)行分析。利用熒光定量PCR技術(shù)對草地貪夜蛾不同發(fā)育時(shí)期及6齡幼蟲不同組織表達(dá)量進(jìn)行分析，推測其在草地貪夜蛾生長發(fā)育過程中的功能。同時(shí)通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功對Sf-caspase-3進(jìn)行原核表達(dá)。本研究為進(jìn)一步研究Sf-caspase-3功能及鱗翅目昆蟲細(xì)胞凋亡機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

草地貪夜蛾幼蟲由本實(shí)驗(yàn)室采用人工飼料進(jìn)行飼喂，成蟲采用10%蜂蜜水飼養(yǎng)。室內(nèi)飼養(yǎng)條件為：26±1℃，RH 75%，光照周期為12 L ∶12 D。

1.2 草地貪夜蛾Sf-caspase-3基因克隆及序列分析

1.2.1草地貪夜蛾RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

收集不同齡期的草地貪夜蛾幼蟲進(jìn)行混合，液氮研磨后采用RNAiso Plus(TaKaRa)試劑進(jìn)行草地貪夜蛾總RNA提取。總RNA采用1.0%瓊脂糖凝膠檢測完整性；微量紫外分光光度計(jì)Nanodrop-100(Thermo Fisher)測定其濃度。根據(jù)PrimeScriptTMII 1stStrand cDNA Synthesis Kit操作說明，以1.0 μg總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板，Oligo dT Primer為引物進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。合成的cDNA用于后續(xù)Sf-caspase-3基因克隆。

1.2.2引物設(shè)計(jì)及合成

本研究前期通過Blast等技術(shù)比對草地貪夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定得到Sf-caspase-3基因編碼區(qū)全長序列。為確定得到的Sf-caspase-3基因序列可靠性，本研究根據(jù)序列設(shè)計(jì)編碼區(qū)特異性引物Sf-caspase-3-CDS-F和Sf-caspase-3-CDS-R并由賽默飛世爾科技公司合成。本研究中用到的所有引物序列詳見表1。

表1 本研究中使用的引物

1.2.3PCR擴(kuò)增、電泳檢測及測序

以合成的第一鏈cDNA為模板，Sf-caspase-3-CDS-F和Sf-caspase-3-CDS-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系如下：10 ×LATaqBuffer II 5.0 μL，dNTP Mixture(2.5 mM each)8.0 μL，cDNA 0.5 μL，上下游引物各1.0 μL，LATaq0.5 μL，34.0 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性3.0 min，95℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸1.0 min，32個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后采用Universal DNA純化回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收后與pMD-19T載體連接，16℃孵育2 h后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素篩選后挑選單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行菌液PCR，最終選取陽性克隆子進(jìn)行測序。

1.2.4生物信息學(xué)分析

利用DNAman6推導(dǎo)Sf-caspase-3基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列、相對分子量等理化性質(zhì)。采用在線軟件HMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對Sf-caspase-3跨膜區(qū)域和信號肽進(jìn)行預(yù)測。采用PTOSITE(http://www.expasy.org/prosite)預(yù)測Sf-caspase-3的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及關(guān)鍵活性位點(diǎn)。利用BlastP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行氨基酸同源性分析，查找并下載已知的其他物種Sf-caspase-3同源序列。利用DNAman6對選取的部分鱗翅目昆蟲Sf-caspase-3氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對，分析鱗翅目昆蟲caspase-3氨基酸結(jié)構(gòu)的保守區(qū)域。采用軟件MEGAX中ClustalW對caspase-3氨基酸序列進(jìn)行比對，利用鄰位相連法(Neighbor-joining，參數(shù)為：Botstrap方法，Poisson模型，1 000次重復(fù))構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。所構(gòu)建的進(jìn)化樹采用MEGAX進(jìn)行編輯和可視化。采用SWISS-MODEL對Sf-caspase-3進(jìn)行3D建模。

1.3 Sf-caspase-3基因時(shí)空表達(dá)分析

1.3.1樣品收集

于草地貪夜蛾不同發(fā)育時(shí)期挑選一定數(shù)量的卵、幼蟲、蛹及雌雄成蟲置于1.5 mL離心管中，液氮速凍后于-80℃冰箱保存。同時(shí)選取6齡幼蟲進(jìn)行組織解剖，分別收集草地貪夜蛾幼蟲的頭部、表皮、脂肪體、中腸、馬氏管等組織，PBS緩沖液中洗凈后置于1.5 mL離心管中，液氮速凍后于-80℃冰箱保存。

1.3.2RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR

采用液氮將樣品磨碎后加入RNAiso Plus(TaKaRa)試劑進(jìn)行草地貪夜蛾不同齡期和組織樣品的總RNA提取。測定各個(gè)樣品總RNA純度和濃度后選取等量的總RNA，采用FastKing RT Kit(With gDNase)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。合成的cDNA稀釋5倍后作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。10 μL反應(yīng)體系為：TransStart Tip Green qPCR SuperMix 5.0 μL，基因上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，加ddH2O補(bǔ)足10 μL，震蕩混勻，簡短離心后進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃變性3 min；95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s循環(huán)45次；最后熔解曲線步驟為95℃ 5 s，65℃ 1 min，40℃ 30 s。采用2-ΔΔCt法對Sf-caspase-3時(shí)空表達(dá)情況進(jìn)行分析，不同實(shí)驗(yàn)條件下選用的內(nèi)參基因不同，其中不同發(fā)育階段以EF2和RPL13作為內(nèi)參基因；幼蟲不同組織以RPL13和β-1-TUB為內(nèi)參基因。實(shí)驗(yàn)所需基因引物如表1所示。

1.4 Sf-caspase-3原核表達(dá)分析

根據(jù)上述已知Sf-caspase-3編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的編碼區(qū)引物Sf-caspase-3-CDS-F(BamHI)和Sf-caspase-3-CDS-R(HindIII)。采用LATaq聚合酶進(jìn)行Sf-caspase-3基因編碼區(qū)克隆。pET32a質(zhì)粒及純化回收后的目的片段采用限制性內(nèi)切酶BamHI及HindIII(ThermoFisher公司)雙酶切。酶切產(chǎn)物采用T4 DNA連接酶(ThermoFisher公司)于22℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素篩選后挑選單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行菌液PCR，最終選取陽性克隆子進(jìn)行測序。將陽性克隆子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃孵育過夜后采用質(zhì)粒提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)進(jìn)行重組質(zhì)粒pET32a-Sf-caspase-3提取。獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)中，氨芐青霉素篩選后挑選單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行菌液PCR，最終選取陽性克隆子用于后續(xù)蛋白表達(dá)。

陽性克隆子接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃ 200 r/min孵育過夜。將過夜孵育的菌接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，待菌液A260≥0.6后加入0.4 mmol/L IPTG于28℃下進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。孵育4 h后吸取1 mL菌液離心，去除上清后加入100 μL PBS重懸，然后加入蛋白上樣緩沖液，混勻后100℃孵育10 min備用。同時(shí)將剩余的菌液離心收集菌體。超聲波破碎儀破碎菌體后4℃ 12 000 rpm離心10 min。分別收集上清和沉淀，沉淀用2 mL PBS重懸。分別取200 μL上清和沉淀并加入蛋白上樣緩沖液，混勻后100℃孵育10 min。所有的蛋白樣品各取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)G-250染色2 h后進(jìn)行脫色液脫色，觀察分析蛋白在上清和沉淀中的表達(dá)情況。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)”表示。采用SPSS 17.0軟件對時(shí)空表達(dá)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，多重檢驗(yàn)法(DMRT法)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sf-caspase-3基因生物信息學(xué)分析

通過Blast比對成功鑒定得到Sf-caspase-3基因序列編碼區(qū)全長。Sf-caspase-3基因編碼區(qū)長840 bp，編碼279個(gè)氨基酸，ExPASy預(yù)測Sf-caspase-3編碼蛋白分子量大小為31.43 kDa，等電點(diǎn)為6.50，預(yù)測分子式為C1397H2206N370O425S14。HMHMM分析發(fā)現(xiàn)Sf-caspase-3無跨膜結(jié)構(gòu)域。SignalP-4. 0 Server分析結(jié)果預(yù)測該蛋白無信號肽區(qū)域，編碼的氨基酸為成熟肽。PROSITE分析表明Sf-caspase-3具有典型的執(zhí)行caspase結(jié)構(gòu)特征：短的原結(jié)構(gòu)域，caspase家族p20大亞基(51-174)和p10小亞基(187-279)。同時(shí)Sf-caspase-3蛋白含有半胱氨酸活性位點(diǎn)KPKLFFVQACRG和組氨酸活性位點(diǎn)HSKTSCICITILTHG。

圖1 Sf-caspase-3基因編碼區(qū)序列及其對應(yīng)的氨基酸序列Fig.1 ORF region of Sf-caspase-3 and the deduced amino acid sequence注：橫杠標(biāo)注的位置為保守五肽序列QACRG。Note: The position indicated by the horizontal bar is the conservative pentapeptide sequence QACRG.

2.2 Sf-caspase-3多重序列比對及進(jìn)化分析

將Sf-caspase-3氨基酸序列在NCBI進(jìn)行BlastP比對，發(fā)現(xiàn)Sf-caspase-3與多種鱗翅目昆蟲Lep-caspase-3相似性在48.26%～91.81%之間，其中與斜紋夜蛾 Sl-caspase-3相似性最高。多重序列比對結(jié)果顯示Sf-caspase-3與多數(shù)鱗翅目昆蟲caspase-3序列具有高度的一致性(圖2)。從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取具有近20種昆蟲物種的caspase-3氨基酸序列，采用Clustal W對所有氨基酸進(jìn)行比對后采用MEGAX軟件中的Neighbor-Joining法(Bootstrap法以Poisson模型重復(fù)構(gòu)建1 000次)進(jìn)行caspase-3系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。結(jié)果如圖3所示，Sf-caspase-3與甜菜夜蛾及甘藍(lán)夜蛾等夜蛾科昆蟲caspase-3親緣關(guān)系較近，與傳統(tǒng)上的分類基本一致。

2.3 Sf-caspase-3蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及3D結(jié)構(gòu)模擬

采用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，蛋白氨基酸序列同源比對結(jié)果顯示Sf-caspase-3蛋白與人源caspase-3(Apopain)蛋白(PDB ID:1qx3.1.A)氨基酸序列相似度高達(dá)34.75%。以人caspase-3三級結(jié)構(gòu)為模板進(jìn)行Sf-caspase-3三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，定性模型的能量分析(Qualitative Model Energy Analysis，QMEAN)為-5.09，序列覆蓋率為85%。Sf-caspase-3三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明其主要由α螺旋和β折疊組成，中間由β轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲進(jìn)行連接(圖4)。

2.4 Sf-caspase-3基因在不同發(fā)育時(shí)期及組織中的表達(dá)量分析

RT-qPCR結(jié)果表明草地貪夜蛾Sf-caspase-3基因在不同齡期均有表達(dá)。其中高齡幼蟲期表達(dá)量最高，而在卵期、初孵幼蟲期及蛹期表達(dá)量較低(圖5-A)。草地貪夜蛾6齡幼蟲不同組織基因表達(dá)量分析結(jié)果表明Sf-caspase-3在中腸表達(dá)量最高，其次是頭部，而在表皮、脂肪體及馬氏管表達(dá)量均極低(圖5-B)。

2.5 Sf-caspase-3在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pET32a-Sf-caspase-3的大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果表明未加入IPTG誘導(dǎo)的樣品中沒有明顯的目標(biāo)蛋白條帶出現(xiàn)，而IPTG誘導(dǎo)的樣品中出現(xiàn)明顯蛋白條帶，且大小約為50 kDa，與預(yù)測的蛋白大小基本相符(圖6)。上述結(jié)果表明Sf-caspase-3能夠成功在大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。對上清和沉淀的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果表明上清中目標(biāo)蛋白條帶較淡，而在沉淀中出現(xiàn)明顯的目標(biāo)蛋白帶。以上結(jié)果表明Sf-caspase-3在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中主要以不可溶的包涵體形式存在(圖6)。

圖2 Sf-caspase-3與其他鱗翅目昆蟲caspase-3多重序列比對結(jié)果Fig.2 A multiple sequence alignment of Sf-caspase-3 together with caspase-3 from other lepidopteran insects注：紅色和綠色部分序列為高度保守區(qū)域。用于多重序列比對的其他鱗翅目caspase-3 GeneBank登錄號如下：Note: The red and green bases in the figure indicate highly conserved regions. GeneBank accession numbers of caspase-3 from different Lepidoptera species were showed as following:斜紋夜蛾Spodoptera litura(AFJ04534.1)；海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis(AEK20824.1)；甜菜夜蛾Spodoptera exigua(AEK20823.1)；棉鈴蟲Helicoverpa armigera(AEK20819.1)；煙芽夜蛾Heliothis virescens(AEK20820.1)；甘藍(lán)夜蛾Mamestra brassicae(AEK20822.1)；金堇蛺蝶Euphydryas aurinia(AEF30499.1)；玉帶鳳蝶Papilio polytes(XP_013133991.1)。

圖3 基于氨基酸序列構(gòu)建的草地貪夜蛾及其他昆蟲caspase-3的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of insect caspase-3注：用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的caspase-3氨基酸序列包括：Note: The amino acid sequences of Caspase-3 from different insects used for phylogenetic tree construction were listed as following：斜紋夜蛾Spodoptera litura(Sl-caspase-3: AFJ04534.1)；海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis(Sl-caspase-3: AEK20824.1)；甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Se-caspase-3: AEK20823.1)；棉鈴蟲Helicoverpa armigera(Ha-caspase-3: AEK20819.1)；煙芽夜蛾Heliothis virescens(Hv-caspase-3: AEK20820.1)；家蠶Bombyx mori(Bm-ICE5: NP_001106741.1; Bm-ICE2: ABC94941.1; Bm-ICE: NP_001037297.1)；甘藍(lán)夜蛾Mamestra brassicae(Mb-caspase-3: AEK20822.1)；粉蝶Eucheira socialis(Es-caspase-3: AEK20817.1)；金堇蛺蝶Euphydryas aurinia(Ea-caspase-3: AEF30499.1)；玉帶鳳蝶Papilio polytes(Pp-caspase-3: XP_013133991.1)；柑橘鳳蝶Papilio xuthus(Px-caspase-3: XP_013181072.1)；金鳳蝶Papilio machaon(Pm-caspase-3: XP_014362694.1)；大蠟螟Galleria mellonella(Gm-caspsae-3: AEK20818.1)；煙草天蛾Manduca sexta(Ms-caspase-3: XP_030036027.1)和意大利蜜蜂and Apis mellifera(Am-caspase-3: XP_394855.4)。

圖4 草地貪夜蛾Sf-caspase-3蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Predicted 3D structure model of Spodoptera frugiperda Sf-caspase-3

圖5 Sf-caspase-3在草地貪夜蛾不同發(fā)育時(shí)期及6齡幼蟲不同組織中mRNA水平相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of Sf-caspase-3 in different developmental stages and different tissues of 6th larvae of Spodoptera frugiperda注：A，Sf-caspase-3在不同發(fā)育時(shí)期mRNA水平相對表達(dá)量。Egg，卵；L1，1齡幼蟲；L2，2齡幼蟲；L3，3齡幼蟲；L4，4齡幼蟲；L5，5齡幼蟲；L6，6齡幼蟲；P，蛹；FM，雌成蟲；M，雄成蟲。B，Sf-caspase-3在6齡幼蟲不同組織中mRNA水平相對表達(dá)量。HE，頭部；CT，表皮；FB，脂肪體；MG，中腸；MT，馬氏管。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；柱上標(biāo)有不同的字母表示差異顯著(P<0.05, DMRT法)。Note: A，Relative expression levels of Sf-caspase-3 in different developmental stages of S. frugiperda. L1, 1st instar larvae; L2, 2nd instar larvae; L3, 3rd instar larvae; L4, 4th instar larvae; L5, 5th instar larvae; L6, 6th instar larvae; P, pupae; FM, female adult; M, male adult. B， mRNA expression levels of Sf-caspase-3 in different tissues of 6th larvae. HE, head; CT, cuticle; FB, fat body; MG, midgut; MT, malpighian tubules. Data are mean±SE. Histograms with different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05, Duncan’s multiple range test in one way ANOVA).

圖6 Sf-caspase-3在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析Fig.6 Expression profiles and soluble analysis of Sf-caspase-3 induced by IPTG in Escherichia coli注：M，蛋白Marker；泳道1，未加IPTG誘導(dǎo)重組菌株蛋白表達(dá)情況；泳道2，0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h重組菌株蛋白表達(dá)情況；泳道3，菌體破碎離心后上清蛋白表達(dá)情況；泳道4，菌體破碎離心后沉淀蛋白表達(dá)情況。Note: M, Protein Marker; Lane 1, Protein expression profiles of recombinant E. coli strain without IPTG induction; Lane 2, Protein expression profiles of recombinant E. coli strain induced by 0.4 mmol/L IPTG for 4 h; Lane 3, Protein expression profiles of supernatant solution; Lane 4, Protein expression profiles of bacterial precipitation.

3 結(jié)論與討論

本研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及克隆得到草地貪夜蛾Sf-caspase-3基因編碼區(qū)序列；利用生物信息學(xué)軟件分析Sf-caspase-3基本信息；運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)對Sf-caspase-3在草地貪夜蛾不同發(fā)育時(shí)期及6齡幼蟲不同組織中轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量進(jìn)行分析；構(gòu)建Sf-caspase-3原核表達(dá)重組質(zhì)粒并成功表達(dá)Sf-caspase-3原核蛋白。本研究為進(jìn)一步豐富鱗翅目caspases基因數(shù)據(jù)庫，深入研究Sf-caspase-3基因功能及解析鱗翅目昆蟲細(xì)胞凋亡機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

細(xì)胞凋亡是有機(jī)體為維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，主動(dòng)有序地清除不必要細(xì)胞的死亡過程。目前在模式生物秀麗小桿線蟲Caenorhabditiselegans、黑腹果蠅及哺乳動(dòng)物中細(xì)胞凋亡機(jī)制研究比較全面且深入。而鱗翅目昆蟲細(xì)胞凋亡相關(guān)研究相對較少，目前主要集中在兩方面：一是研究凋亡刺激后形態(tài)學(xué)及生理學(xué)變化；二是關(guān)鍵凋亡相關(guān)基因的功能分析(Shuetal., 2019)。Caspases是執(zhí)行細(xì)胞凋亡過程的主要酶類，所引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。近些年來關(guān)于鱗翅目昆蟲caspase家族基因的研究越來越豐富，目前Lep-caspase-3在多種鱗翅目昆蟲中均得到鑒定，這對于全面了解caspases及解析鱗翅目昆蟲細(xì)胞凋亡機(jī)制具有重要意義(Courtiadeetal., 2011)。本研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和克隆驗(yàn)證Sf-caspase-3基因編碼區(qū)序列。Sf-caspase-3氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)其具有高度保守的五肽序列(QACRG),與Lep-caspase-3的五肽序列完全一致。同時(shí)Sf-caspase-3具有Lep-caspase-3的典型蛋白結(jié)構(gòu)：一段短的原結(jié)構(gòu)域，Caspase家族p20亞基和Caspase家族p10亞基。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明Sf-caspase-3與夜蛾科昆蟲caspase-3親緣關(guān)系最近，進(jìn)一步證實(shí)caspase-3進(jìn)化過程中的保守性。

在鱗翅目昆蟲卵-幼蟲-蛹-成蟲整個(gè)發(fā)育過程中細(xì)胞凋亡扮演著重要的角色，包括參與去除多余細(xì)胞及組織降解等(包希艷等, 2017；Tettamanti and Casartelli, 2019)。本研究通過熒光定量PCR技術(shù)對不同發(fā)育時(shí)期Sf-caspase-3轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明Sf-caspase-3在草地貪夜蛾整個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，其中在3～6齡幼蟲期表達(dá)量最高，在卵及蛹期表達(dá)量最低。而鱗翅目昆蟲蟲態(tài)轉(zhuǎn)變時(shí)一般凋亡發(fā)生比較嚴(yán)重，caspases表達(dá)量較其他時(shí)期高。例如二化螟Cs-caspase-1和家蠶BmDronc在老熟幼蟲和蛹期表達(dá)量最高(Luetal., 2013; Zhangetal., 2013)。本研究結(jié)果與前期研究結(jié)果有所差別。導(dǎo)致出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能有兩個(gè)：一是Sf-caspase-3在草地貪夜蛾細(xì)胞凋亡中的作用并不突出，并不是主要的caspase酶類參與細(xì)胞凋亡；而Sf-caspase-1可能作為主要的執(zhí)行caspase參與變態(tài)發(fā)育過程中細(xì)胞凋亡事件的完成。二是Sf-caspase-3可能存在其他非凋亡執(zhí)行功能參與草地貪夜蛾的生長發(fā)育過程，具體的功能有待進(jìn)一步研究。此外，6齡幼蟲不同組織中Sf-caspase-3轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量分析表明其在中腸中表達(dá)量最高，而在表皮、脂肪體及馬氏管中表達(dá)量極低。推測Sf-caspase-3在草地貪夜蛾中腸組織特異高表達(dá)可能與中腸組織對食物的響應(yīng)有關(guān)，具體的功能有待進(jìn)一步研究。

此外，本研究構(gòu)建Sf-caspase-3原核表達(dá)重組質(zhì)粒；并于大腸桿菌BL21(DE3)菌株成功誘導(dǎo)表達(dá)Sf-caspase-3原核蛋白。蛋白可溶性分析發(fā)現(xiàn)Sf-caspase-3原核蛋白在本研究實(shí)驗(yàn)條件下主要以包涵體形成存在。后續(xù)進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)需要考慮調(diào)整IPTG濃度、降低誘導(dǎo)溫度及轉(zhuǎn)速等條件增加可溶性蛋白含量，保證蛋白純化的成功率。