草地貪夜蛾幼蟲僵蟲發(fā)生率調(diào)查及致病菌分離鑒定

程?hào)|美，洪婉雯，孫 輝，華宏偉，張子楓，徐漢虹，張志祥*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣州 510225；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，廣州 510642)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(J.E.Smith)，屬于鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，原分布于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)。2019年1月13日草地貪夜蛾入侵我國(guó)云南省(楊普云等, 2019)，4月23日廣東省廣州市增城區(qū)發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾幼蟲入侵為害(廖永林等, 2019)，截至6月4日，已經(jīng)入侵了長(zhǎng)江流域及其以南的18個(gè)省(市、自治區(qū))，嚴(yán)重威脅我國(guó)農(nóng)業(yè)及糧食生產(chǎn)(全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心, 2019)。草地貪夜蛾各齡幼蟲均可產(chǎn)生為害，取食玉米的葉片、穗軸、籽粒，所到之處肆虐暴食，輕則導(dǎo)致田塊斑駁、莖葉殘缺，重則毀種，嚴(yán)重威脅玉米生產(chǎn)(張丹丹等, 2019)。

藥劑防治是控制草地貪夜蛾為害的主要方法(趙勝園等, 2019)，目前我國(guó)尚無防治該蟲的登記農(nóng)藥，根據(jù)《農(nóng)藥管理?xiàng)l例》有關(guān)規(guī)定，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在專家論證的基礎(chǔ)上，提出了25種應(yīng)急使用的農(nóng)藥產(chǎn)品，推薦給農(nóng)民使用。25個(gè)產(chǎn)品中有17個(gè)單劑和9個(gè)以甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、高效氯氟氰菊酯為主要成分的二元混配制劑，單劑含11個(gè)化學(xué)農(nóng)藥和6個(gè)生物農(nóng)藥，白僵菌是推薦的產(chǎn)品之一(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部, 2019)。

白僵菌是研究應(yīng)用最為廣泛的廣譜性昆蟲病原性真菌之一，屬于半知菌亞門絲孢綱叢梗孢目叢梗孢科白僵菌屬，應(yīng)用較為廣泛的有球孢白僵菌Beauveriabassiana和布氏白僵菌(卵孢白僵菌)B.brongniatii(高紅等, 2011)。該菌分布廣，寄生能力強(qiáng)且范圍廣，可侵染700余種昆蟲和10多種蜱螨類害蟲，且對(duì)人畜無害，因而已被廣泛開發(fā)并應(yīng)用于有害生物防治(田佳等, 2018)。我國(guó)關(guān)于白僵菌的研究與應(yīng)用處于世界先進(jìn)水平，白僵菌產(chǎn)量全球第一，已成功應(yīng)用于大面積防治農(nóng)林業(yè)害蟲，如玉米螟Ostrinianubilalis、大豆食心蟲LeguminivoraglycinivorellaMatsumura、松毛蟲Dendrolimus等(李增智和樊美珍, 2000; 余素紅等, 2009)。利用白僵菌防治草地貪夜蛾具有安全性高、可持續(xù)性好、害蟲不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)外在利用白僵菌防治草地貪夜蛾方面也做了很多研究，如Gutierrez等(2018)分離出一株球孢白僵菌，處理72 h后草地貪夜蛾幼蟲死亡率達(dá)100%。白僵菌還能夠與多種殺蟲混用，提高殺蟲活性，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，如Rivero-Borja等(2018)研究發(fā)現(xiàn)白僵菌與多殺菌素聯(lián)用對(duì)草地貪夜蛾幼蟲具有增效作用。廣東省植物重大災(zāi)害綜合防控共性關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)2019年5月初在廣州地區(qū)調(diào)查草地貪夜蛾為害時(shí)，發(fā)現(xiàn)幼蟲被真菌侵染和白僵蟲，該項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)隨即對(duì)花都、番禺、增城等地草地貪夜蛾幼蟲的僵蟲率進(jìn)行了調(diào)查，并對(duì)致病菌進(jìn)行了分離和初步鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 草地貪夜蛾幼蟲僵蟲率調(diào)查

先后在廣州市花都區(qū)花東鎮(zhèn)聯(lián)安村、番禺區(qū)大石街會(huì)江村、增城石灘鎮(zhèn)舊山嚇村玉米地進(jìn)行調(diào)查，調(diào)查采用普查法和抽樣調(diào)查法相結(jié)合。對(duì)發(fā)生較輕的玉米地，采用抽樣調(diào)查法；對(duì)發(fā)生較重的農(nóng)田，采用普查法。

抽樣調(diào)查法：花都聯(lián)安村調(diào)查地塊玉米受害呈明顯點(diǎn)片狀，以每受害點(diǎn)為中心，調(diào)查直至無蟲害狀，然后根據(jù)玉米的密度，估算玉米總株數(shù)。普查法：增城、番禺兩地為害較重，對(duì)試驗(yàn)田塊所有玉米進(jìn)行調(diào)查，采集幼蟲，記錄受害株數(shù)、總蟲數(shù)。將典型被真菌感染的幼蟲或蟲尸單頭置于指形管，以脫脂棉塞住管口，帶回實(shí)驗(yàn)室置于溫度27～29℃，相對(duì)濕度50%～70%，光周期L ∶D=16 h ∶8 h的培養(yǎng)箱中，幼蟲以玉米嫩葉加人工飼料混合飼養(yǎng)至化蛹，連續(xù)觀察幼蟲的存活情況，死亡幼蟲在上述環(huán)境保濕放置14 d，記錄出現(xiàn)的僵蟲數(shù)，計(jì)算僵蟲比率。

1.2 白僵蟲致病菌分離純化

田間采集的白僵蟲致病菌分離方法參考田佳等(2018)、馮玉元(2018)并適當(dāng)調(diào)整。接菌后的PDA平板置于27～29℃，相對(duì)濕度50%～70%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

方法一是選擇蟲體中部切成小塊，浸入70%乙醇中3～5 min，取出后，再浸入次氯酸鈉溶液2 min，然后用無菌水沖洗3次，取2～3塊均勻放置于加有乳酸的PDA平板表面倒置培養(yǎng)。

方法二是以無菌接種針挑取蟲體表面白色孢子粉，接種針置于PDA平板上方2～3 cm，輕拍手腕，觀察有孢子落下后將PDA平板倒置培養(yǎng)。

由方法一和方法二分離的菌落再分離培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出絨毛狀菌絲后，切新生菌絲轉(zhuǎn)移到水瓊脂培養(yǎng)基，生長(zhǎng)1 d后，用滅菌小手術(shù)刀挑取單根菌絲接在新PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。由2種分離純化獲得6株真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定，每一株真菌都具有十分相似的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)，將其視為同一種菌，并命名為ZKQB3。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將ZKQB3接種到PDA培養(yǎng)基上，于27～29℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),記錄菌落特征及其直徑。培養(yǎng)7 d時(shí)，待菌落表面有孢子粉時(shí)，挑取菌絲制成玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子、孢子梗以及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。選取已明顯產(chǎn)孢的PDA平板，挑取菌絲和孢子制片，采用Hitachi S-3000N掃描電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

PCR擴(kuò)增：引物選取真菌常用的ITS1和ITS4，引物由廣州華大基因公司合成。PCR反應(yīng)體系：DNA 1L、ITS1 1L、ITS4 1L、Taq PCR mix液12.5L、無菌水9.5L。PCR反應(yīng)條件是94℃ 3 min預(yù)變性；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 40 s，進(jìn)行30循環(huán)后72℃延伸10 min。1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)擴(kuò)增成功后送往廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司測(cè)序。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)序列進(jìn)行編輯，去除兩端質(zhì)量差的堿基，將優(yōu)化好的ITS序列提交到NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，使用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)。序列在BLAST后下載相似性大于84%的序列及其相關(guān)近緣屬菌株的ITS序列，用MEGA 7.0進(jìn)行序列處理，應(yīng)用最大似然法(ML)，運(yùn)行1 000次bootstrap驗(yàn)證，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株致病性及最適濃度測(cè)定

感染試驗(yàn)所采用的清水和對(duì)照均為含0.1%吐溫-80和100 mg/L農(nóng)用鏈霉素的無菌水，供試?yán)ハx為草地貪夜蛾3齡幼蟲。

1.5.1僵蟲體表孢子致病性測(cè)定

以昆蟲針輕挑或輕刮，并用無菌水沖洗僵蟲表面，將表面白色孢子粉充分洗脫，再振蕩15 min，制成孢子懸浮液，以血球計(jì)算板計(jì)數(shù)，然后稀釋配制成濃度為1×105、1×106、1×107、1× 108cfu/mL的分生孢子懸浮液。將供試草地貪夜蛾幼蟲在孢子懸液中浸3 s后取出，置于濾紙上，待蟲體表面無明顯液體時(shí)置于玻璃指形管中單頭正常飼養(yǎng)。

1.5.2離體培養(yǎng)孢子致病性(活性)測(cè)定

選取分離并純化的ZKQB3菌株在PDA培養(yǎng)15 d，刮取菌落表面孢子至0.1%吐溫-80+100 mg/L農(nóng)用鏈霉素的無菌水中，充分振蕩后稀釋成濃度為1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL的分生孢子懸浮液。浸染方法同1.5.1。

每濃度處理10頭，重復(fù)3次；對(duì)照以無菌水處理，每天觀察并檢查死亡情況。死蟲置于指形管、27～29℃培養(yǎng)箱保濕放置，連續(xù)觀察15 d。將蟲體僵硬、體表有菌絲或孢子長(zhǎng)出的死蟲判為僵蟲，計(jì)算死亡率、侵染率。

2 結(jié)果與分析

2.1 草地貪夜蛾僵蟲癥狀及發(fā)生率調(diào)查

2019年5月至6月，在廣州的花都、番禺和增城等三區(qū)的4塊玉米田調(diào)查均發(fā)現(xiàn)入侵草地貪夜蛾幼蟲被寄生，白僵蟲(圖1)較為普遍。白僵蟲蟲體密被白色(孢子)粉，多數(shù)僵蟲頭向上，可見黑色頭殼，多在植株中上部發(fā)生，心葉、喇叭口、末展開的雄蕊上僵蟲數(shù)量多，個(gè)體大；完全展開的葉片上數(shù)量少，僵蟲個(gè)體小。僵蟲多為3～5齡幼蟲，2齡幼蟲的僵蟲較少，末發(fā)現(xiàn)初孵幼蟲和蛹被感染。

各調(diào)查點(diǎn)僵蟲發(fā)生率有明顯不同(表1)。5月6日花都聯(lián)安村玉米地，該調(diào)查點(diǎn)玉米受害率較低，有明顯的為害中心，玉米受害呈明顯的片狀，每個(gè)受害點(diǎn)約有10～15株玉米有明顯的受害狀，田間僵蟲少，累積僵蟲率為12.00%。5月10日番禺會(huì)江村玉米地，草地貪夜蛾發(fā)生普遍，玉米受害，受害率達(dá)89.00%，無明顯的為害中心。調(diào)查前期連續(xù)降雨，濕度較大，玉米葉片及喇叭口有明顯水珠，田間僵蟲率為20.99%。采集的幼蟲累積死亡率高，死亡幼蟲保濕培養(yǎng)后呈明顯的白僵蟲癥狀，累積僵蟲率43.21%。調(diào)查后即進(jìn)行喇叭口顆粒施藥，7 d后再次調(diào)查，玉米進(jìn)入花粒期，雄蕊已完全展開，葉片受害較輕，新形成的蟲孔少，果穗及未完全展開的雄蕊受害較重，田間僵蟲自然發(fā)生率8.70%，僵蟲累積比率為9.52%。6月5日舊山嚇村，該調(diào)查點(diǎn)玉米田草地貪夜蛾發(fā)生普遍，除試驗(yàn)田塊外，農(nóng)田均以常規(guī)殺蟲劑進(jìn)行噴霧處理，玉米受害率下降。試驗(yàn)玉米田未進(jìn)行藥劑處理，玉米受害較重，受害率達(dá)78.00%，僵蟲自然發(fā)生率為6.67，累積僵蟲率為13.33%。

圖1 草地貪夜蛾幼蟲感染白僵菌癥狀Fig.1 Infection symptom of Spodoptera furgiperda larvae by Beauveria

表1 草地貪夜蛾幼蟲僵蟲發(fā)生率調(diào)查

2.2 形態(tài)鑒定結(jié)果

ZKQB3菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形，菌絲較茂密，短絨毛狀，正面白色，背面淡黃色(圖2-A1，A2)。經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察，3號(hào)菌株產(chǎn)孢細(xì)胞為瓶狀，簇生于菌絲頂端或其分枝上，直或彎曲(圖2-B2)。分生孢子透明，卵圓形或近球形，無色，表面光滑，大小為1.59～4.88 μm0.86～2.06 μm(圖2-B1)。經(jīng)掃描電鏡觀察，分生孢子卵圓形(圖2-C1)，分生孢子簇生于分生孢子梗“之”字形分支末端(圖2-C2)。根據(jù)培養(yǎng)基培養(yǎng)特征，其產(chǎn)生的分生孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的顯微和超微形態(tài)，鑒定菌株ZKQB3為白僵菌Beauveriasp.。

2.3 分子鑒定結(jié)果

以引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)菌株ZKQB3測(cè)定所得ITS序列修剪編輯，去除兩端質(zhì)量不好的堿基，再導(dǎo)入NCBI中進(jìn)行Blast比較，與球孢白僵菌Beauveriabassiana的同源性達(dá)到99%以上，和數(shù)據(jù)庫(kù)中的球孢白僵菌聚成一簇，兩者高度相似性。綜合形態(tài)特征鑒定和ITS序列相似性分析，確定該菌株為白僵菌屬球孢白僵菌。

圖2 球孢白僵菌ZKQB3形態(tài)Fig.2 Morphology of Beauveria bassiana ZKQB3注：A，PDA菌落形態(tài)；B，光學(xué)顯微形態(tài)結(jié)果(分生孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu))；C，掃描電鏡超微結(jié)構(gòu)(分生孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu))。Note: A, Colonial morphology on PDA medium; B, Optical microscopic morphology (conidiospore, sporulation structure); C, Scanning electron ultrastructure (conidiospore, sporulation structure)

圖3 基于ITS序列ZKQB3菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of ZKQB3 strain based on ITS sequence

2.4 白僵菌菌株的致病性和最適濃度測(cè)定

僵蟲體表和PDA平板上洗脫的孢子制成的孢子懸浮液均能感染草地貪夜蛾3齡幼蟲，被感染幼蟲癥狀相似，3 d時(shí)幼蟲活動(dòng)力下降，取食減少，生長(zhǎng)緩慢，體長(zhǎng)明顯小于對(duì)照，通過體視鏡放大，可觀察到個(gè)別蟲體側(cè)面有菌絲；第4天有試蟲死亡；處理后第5天，體表明顯白色菌絲，顯微鏡下觀察菌絲有隔，未觀察到孢子。兩種來源孢子對(duì)幼蟲均有致病作用(表2)，濃度為1×107cfu/mL時(shí)的死亡率均為78.57%；濃度為1×108cfu/mL時(shí)的校正死亡率分別為85.71%和82.14%，且與1×107cfu/mL處理的效果差異不顯著。

表2 僵蟲體表和分離培養(yǎng)的白僵菌孢子對(duì)草地貪夜蛾幼蟲的致病性

3 結(jié)論與討論

蟲生真菌種類多，代謝類型復(fù)雜，有顯著的流行潛力和生產(chǎn)的便利性，在害蟲的生物防治中有著極為重要的作用(王聯(lián)德等, 2010)。本文的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，剛?cè)肭謴V州地區(qū)的草地貪夜蛾幼蟲在田間有明顯被真菌寄生現(xiàn)象，田間僵蟲率在6%～21%之間，累積僵蟲率最高達(dá)43.21%，說明廣州地區(qū)具有天然的草地貪夜蛾寄生性真菌，利用蟲生真菌防治該重大入侵害蟲具有適合的環(huán)境和天敵微生物。

白僵菌是最重要的蟲生真菌之一，也是一種優(yōu)良的生物農(nóng)藥，能夠寄生多種昆蟲，其分生孢子與蟲體接觸后，在適宜溫度和濕度條件下迅速萌發(fā)，侵入蟲體，吸取蟲體內(nèi)水分和養(yǎng)分繼續(xù)生長(zhǎng)，最后蟲體充滿菌絲而死亡，死亡的蟲體僵硬并發(fā)白，表面布滿白色粉狀分生孢子，向外飛揚(yáng)，隨風(fēng)傳播，感染其它昆蟲，形成昆蟲流行病(馮玉元, 2018)。昆蟲被寄生而死，對(duì)人畜無毒副作用，對(duì)環(huán)境安全。本文的研究表明，導(dǎo)致廣州地區(qū)草地貪夜蛾僵蟲的主要致病菌為球孢白僵菌，菌株室內(nèi)感染幼蟲后出現(xiàn)白僵蟲，試蟲感染癥狀與蟲體表面孢子直接感染的癥狀一致；對(duì)3齡幼蟲有較好致病作用的孢子濃度為1107個(gè)/mL，累積死亡率與僵蟲體表分離的分生孢子相當(dāng)，表明菌株對(duì)草地貪夜蛾具有較高的致病性，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

通過對(duì)田間僵蟲發(fā)生情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)廣州地區(qū)白僵菌自然發(fā)生普遍，氣候適宜，有利于應(yīng)用推廣利用生防真菌防治草地貪夜蛾。