發酵飼料的混菌復配優化及應用評價

馬娜娜，張心青，楊傳倫，楊丹丹，劉結磊，王秀芝，曹清杰

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東濱州 256500；2.博興紅馬飼料科技有限公司，山東濱州 256500）

發酵飼料主要通過微生物的生長代謝作用或生產代謝過程產生的一些活性物質作用于發酵底料，將其中的大分子物質或抗營養因子分解為更易于動物體吸收的小分子物質從而提高飼料的利用率［1-3］，同時發酵飼料中富含的微生物進入動物腸道后能夠增加腸道有益菌群數量［4］，抑制或降低病原菌數量，從而提高腸道健康［5，6］。

酵母菌、芽孢桿菌及乳酸菌為最常見的可飼用益生菌［7］。酵母菌體中含豐富的蛋白、維生素等營養物質［8］。芽孢桿菌產生的芽孢生命力強，對動物體中的胃液和腸液耐受度高［9］；該菌屬好氧菌，能夠為乳酸菌等厭氧菌提供有利的生長環境［10］；此外，該菌能夠分泌多種酶物質而促進飼料中大分子物質被消化［11，12］。乳酸菌發酵可產生多種有機酸類活性物質，對腸道內的病原菌有較強的抑殺效果［13］；有研究表明乳酸菌發酵后期含有較高的超氧化物歧化酶，對動物體的免疫力提高有顯著效果［14］。混菌發酵就是利用益生菌之間相互作用實現飼料的營養和益生價值最大化。本研究旨在探討混菌發酵飼料中各益生菌復配比例的最優化及其對豬生長性能的影響，研制具有微生物飼料添加劑和發酵飼料雙重特點的復合益生菌發酵飼料，為復合益生菌發酵飼料的生產與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株及動物 飼用菌株：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、EM 酵母、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、納豆芽孢桿菌11083（Bacillus natto）、植物乳桿菌ZP（Lactobacillus plantarum）、產朊假絲酵母（Candida albicans）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

病原菌菌株：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和沙門氏傷寒菌（Salmonella）。

試驗動物：雄性長白豬，88日齡，體重70～80 kg。

1.1.2 試驗溶劑及培養基 人工胃液［15］：取稀鹽酸（1 mol／L）16.4 mL，加水約800 mL及胃蛋白酶10 g，攪勻后加水定容至1 000 mL，充分溶解后用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

人工腸液［15］：取磷酸二氫鉀6.8 g加水500 mL，用0.4%氫氧化鈉溶液調節pH至6.8，另取胰蛋白酶10 g和豬膽鹽3 g加水適量使其溶解，將兩液混合后，加水定容至1 000 mL，充分溶解后用0.22 pm微孔濾膜過濾除菌。

淀粉培養基：酵母膏胨葡萄糖（YPD）瓊脂培養基中添加1%的可溶性淀粉。

脫脂奶粉培養基：5 g脫脂奶粉加50 mL蒸餾水溶解，1.5 g瓊脂粉加50 mL蒸餾水溶解，分別高溫高壓滅菌，冷卻后混合倒板。

纖維素剛果紅培養基：稱取25.3 g纖維素剛果紅，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，分裝，121℃高壓滅菌15 min。

發酵底料：玉米粉∶麩皮∶豆粕 ＝4∶3∶3。

1.2 試驗器材

超凈工作臺VS-840，蘇州尚田潔凈技術有限公司產品；滅菌鍋YXQ-75G，上海博迅實業有限公司產品；恒溫振蕩器SHY-2（THZ-82），常州中捷精密機械有限公司產品；烘箱101-0B，蘇州臺德數控機械有限公司產品；電子天平FB124，上海齊強儀器制造有限公司產品；生化培養箱BJPX，山東博科生物產業有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株篩選 產酸能力評價：無菌條件下用接種環取固體培養基上的單菌落接種于液體培養基中，培養24 h后進行菌液pH檢測。

菌株耐受能力評價：用檸檬酸鹽緩沖液將益生菌培養液離心制備成菌懸液，吸取0.5 mL分別轉接至加有4.5 mL人工胃液或人工腸液的無菌試管中培養，分別取0.5 mL培養1 h和2 h后的培養液進行稀釋涂布，測定活菌數。

對病原菌的拮抗：取培養12 h的病原菌菌液加入到冷卻至適宜溫度的LB固體培養基中，搖勻倒板，用打孔器于平板中間打一個孔，加入50 μL益生菌菌液，每個菌3個平行，之后將平板置于恒溫培養箱中培養過夜，測定抑菌圈大小。

菌株產酶活性檢測：將待測菌液分別滴加到淀粉培養基、脫脂奶粉培養基及纖維素剛果紅培養基上，于培養箱內培養48 h，觀察是否有透明圈。

1.3.2 混菌復配優化 進行菌株的正交設計試驗，通過檢測分析各組發酵飼料的指標，篩選最佳復配組合，檢測指標如下。

pH檢測：參照 NY-T 1377—2007［16］。

水分、粗蛋白 檢 測：參 照 GB／T 5915—2008［17］。

乳酸、游離氨基酸含量檢測：將發酵飼料稀釋10倍后，在搖床勻速振蕩30 min，分別利用乳酸檢測試劑盒、游離氨基酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）進行乳酸、游離氨基酸含量的檢測。

菌量檢測：準確稱取發酵飼料1 g加入帶有玻璃珠的無菌鹽水中，搖床振蕩30 min，進行平板稀釋涂布，每個梯度做兩個平行。

1.3.3 飼料發酵 按量稱取所需物料混合均勻，調節水分至35%左右，接種率6%，接種完成后將菌包放置35℃好氧發酵15～18 h，然后厭氧發酵4 d。

1.3.4 應用評價 設置空白組與混菌飼喂組，每組3個重復，每重復2個平行。對照組飼喂全價料，混菌組飼喂10%發酵飼料＋90%全價料。從試驗第10 d開始取樣，每隔7 d左右取樣一次，檢測豬糞菌量、粗蛋白表觀消化率［18］。試驗結束進行平均日增重和料肉比的計算。試驗周期2個月。

1.4 數據處理與分析

采用Microsoft Excel和正交設計助手軟件對數據進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 飼用菌株的篩選

2.1.1 產酸性能檢測 植物乳桿菌ZP、凝結芽孢桿菌、EM酵母、屎腸球菌及產朊假絲酵母產酸能力相對較強，納豆芽孢桿菌11083呈堿性，不具備產酸能力（圖1）。

圖1 發酵液pH值

2.1.2 抑菌試驗 由表1可知，凝結芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、植物乳桿菌ZP、屎腸球菌及產朊假絲酵母對3株病原菌均具有抑制性，其中凝結芽孢桿菌和植物乳桿菌ZP對3株病原菌的抑菌效果較優。

表1 菌株抑菌圈直徑 （cm）

2.1.3 產酶性能檢測 由表2和圖2可知，納豆芽孢桿菌11083、地衣芽孢桿菌10613、地衣芽孢桿菌11090均具有蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活性，綜合比較地衣芽孢桿菌10613的產酶性能優于其它菌株。

表2 菌株酶活檢測 （cm）

2.1.4 耐受能力試驗 EM酵母和凝結芽孢桿菌對人工胃液和人工腸液均具有良好的耐受能力，除屎腸球菌在人工胃液中不耐受外，其它菌株對人工胃液和人工腸液均有一定耐受性（圖3）。

綜上評價結果，凝結芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌10613 、植物乳桿菌ZP及EM酵母表現出一定的優勢，后續以該4株菌進行混菌復配優化試驗。

2.2 混菌復配優化

2.2.1 混菌復配正交試驗 根據各菌株的生長特性及其發酵飼料的實用性，設計4因素3水平L9（34）的正交試驗，各因素水平見表3。發酵結束后，從外觀看9組發酵飼料均呈黃色，質地均勻，有清香酸味。發酵飼料總菌量最高為8.81×109cfu／g（表4），總菌量最高組各指標均顯示為最優或較優，由此可見總菌量與發酵飼料的品質呈正相關性。以總菌量為依據進行正交試驗，極差分析顯示各因素對發酵飼料總菌量的影響為凝結芽孢桿菌＞植物乳桿菌ZP＞EM酵母＞地衣芽孢桿菌10613（表5）。

表3 混菌復配正交試驗因素水平

2.2.2 正交驗證試驗 根據正交試驗結果進行菌株復配，同時將正交試驗中菌量最高組重新驗證，發酵結束后進行飼料品質評價，結果見表6。A3B2C2D1組菌量達2.01×1010cfu／g，其它指標也均優于A3B3C2D1組，因此，發酵飼料混菌最佳復配比例為凝結芽孢桿菌∶植物乳桿菌ZP∶EM酵母∶地衣芽孢桿菌 10613＝6∶2∶2∶1。

表4 混菌復配發酵結果

圖2 酶活篩選試驗

圖3 菌株耐受能力試驗結果

表5 正交試驗結果分析

表6 正交驗證試驗結果

2.3 應用評價

2.3.1 豬糞菌量 豬糞中大腸桿菌和益生菌含量的變化趨勢見圖4。大腸桿菌數量未存在數量級差異，但飼喂混菌組的大腸桿菌數量始終低于空白組。混菌組益生菌菌量是空白組的100倍，且后期菌量有所增長，說明飼喂混菌發酵飼料后能夠提高豬只體內的有益菌群數量，抑制大腸桿菌的繁殖。

圖4 豬糞菌量變化趨勢

2.3.2 飼料粗蛋白表觀消化率檢測結果 飼喂混菌組對飼料中粗蛋白的表觀消化率優于空白組，并呈遞增趨勢，說明發酵飼料有助于提高豬只對飼料中蛋白的消化吸收（圖5）。

圖5 粗蛋白表觀消化率

2.3.3 平均日增重與料肉比檢測結果 如表7所示，混菌組6頭豬平均日增重的平均值為1.10 kg／d，空白組6頭豬平均日增重的平均值為0.78 kg／d，混菌組較空白組提高了41.03%。混菌組料肉比的平均值為2.46，空白組料肉比為3.02（表8），混菌組較空白組降低18.54%。表明飼喂混菌發酵飼料能夠促進豬只的生長，降低飼喂成本。

表7 增重結果

表8 料肉比結果

3 討論與結論

利用益生菌進行混合連續發酵，與單菌發酵相比，可充分發揮不同菌株間的交互作用，增加飼料中益生菌數量的同時提高飼料的利用效率［19］。本試驗通過菌株篩選、正交試驗確定最佳混菌復配比例為凝結芽孢桿菌∶植物乳桿菌ZP∶EM 酵母∶地衣芽孢桿菌 10613＝6∶2∶2∶1。混菌發酵飼料按照10%的比例加入全價料中進行飼喂，結果表明混菌發酵飼料能夠增加豬只體內有益菌群數量，且對大腸桿菌有一定抑制作用；在豬糞有益菌菌量檢測中均能發現發酵飼料所用的4株菌株，說明其對豬只體內的環境適應性較強；飼喂混菌發酵料可促進豬只對飼料中粗蛋白的消化吸收，豬只平均日增重較空白組提高41.03%，料肉比降低18.54%。這表明飼喂混菌發酵飼料能夠明顯促進豬只生長，降低飼喂成本。可見混菌發酵飼料在動物體防疾病、促生長方面起到積極的作用［20］。