葡萄葉獼猴桃（獼猴桃科）葉綠體全基因組測序

滕曉梅 廖川江 劉暢 徐雨生

摘? ? 要：葡萄葉獼猴桃（獼猴桃科）分布狹窄且現已瀕臨滅絕，本研究完成了對葡萄葉獼猴桃葉綠體全基因組的排序。結果顯示，葡萄葉獼猴桃葉綠體全基因組長度為150 878 bp，其基因組包括130個基因;系統發育樹結果表明，葡萄葉獼猴桃與水東哥為姊妹類群。

關鍵詞：葡萄葉獼猴桃;瀕危物種;葉綠體全基因組測序;系統發育樹

文章編號：1005-2690（2021）21-0023-03? ? ? ?中國圖書分類號：Q943.2;S663.4? ? ? ?文獻標志碼：B

隨著現代分子生物學技術的不斷進步，在植物分子系統學領域中，葉綠體基因組（Chloroplast DNA，

cpDNA）測序的方法已成為植物系統發育研究的最重要方法之一[1]，在物種進化及鑒定中具有重要使用價值。絕大部分葉綠體基因組大小為120～250 kb，呈共價閉合環狀的雙鏈結構且由4個區域組成：一個大單拷貝序列區（Large Single-Copy region，LSC）、一個小單拷貝序列區（Small Single-Copy region，SSC）及一對反向重復序列區（Inverted Repeat region，IR）[2]。與核基因組比較，葉綠體基因組序列具有分子量小、結構穩定且高度保守等優點，在胞質遺傳、植物系統發育和遺傳多樣性等方面發揮著重要作用[3]。

葡萄葉獼猴桃（Actinidia vitifolia）是獼猴桃科、獼猴桃屬大型落葉藤本，主要分布于中國四川馬邊、雷波峨邊、峨邊和云南彝良等地，生長于海拔1 600 m[4]。葡萄葉獼猴桃現已屬瀕危物種，果實的風味甚佳;含有苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等10多種氨基酸以及豐富的礦物質（鈣、磷、鐵），對保持人體健康具有重要的作用;含有較多的果酸，能夠顯著抑制黑色素沉淀及角質細胞內聚力，具有消除或淡化黑斑、改善干性或油性肌膚等功效，被稱為“美容圣果”[5-6]。

獼猴桃屬先被分別置于山茶科（Theacea）或五椏果科（Dilleniaceae），Dunn（1911）[7]首次提出，應將稱獼猴桃屬（Actinidia Lindl）、水東哥屬（Saurauia Willd）、藤山柳屬（Clematoclethra Maxim）分別從五椏果科或山茶科分出放在一起的設想。Gilg（1925）[8]建立了包括這3個近緣屬的獼猴桃科。本研究對葡萄葉獼猴桃葉綠體全基因組進行排序，挑選獲得獼猴桃屬19種、水東哥屬1種，同時挑選剛毛藤山柳作為外類群建立系統發育樹，為更好地開發利用及保護葡萄葉獼猴桃提供了參考依據，同時為遺傳學和系統發育學研究奠定了試驗基礎。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料

葡萄葉獼猴桃樣本葉采自中國云南省太平鎮（28°24′40.76″ E，104°7′50.86″ N），其憑證標本保存于中國科學院昆明植物研究所標本館。

1.2? ?儀器與試劑

移液槍（濟南歐萊博技術有限公司，型號為F3系列）;水浴鍋（上海左樂儀器有限公司），型號為HH-W420;超微量紫外分光光度計（Nano Drop 2000）（上海旦鼎國際貿易有限公司），型號為Anodrop one-c;高通量組織研磨儀（上海達洛科學儀器有限公司），型號為Daxluot-24;冰箱（濟南童鑫生物科技有限公司），型號為BDF-25H110;干燥器，型號為2892;2×CTAB緩沖液（上海尚寶生物科技有限公司），型號為R21954-500;氯仿（分析級），異戊醇（分析級）。

1.3? ?試驗方法

1.3.1? ?DNA提取

在2 mL離心管（加入一顆鋼珠）中裝入約0.2 g待提材料葉片，將離心管轉移至離心管速凍金屬架并放入液氮中速凍2～3 min后，在高通量組織研磨儀中以45 Hz震蕩破碎50 s。分別加入600 μL預熱的2×CTAB緩沖液（65 ℃的水浴鍋中預熱），顛倒混勻后，將離心管放入65 ℃的水浴鍋中溫浴30 min。在離心管中加入600 μL的試劑氯仿和異戊醇（體積比為24∶1），顛倒混勻后， 12 000 rpm離心10 min。在通風櫥中，將400 μL上清液轉移至1.5 mL滅菌離心管中后加入冰冷的異丙醇400 μL，作好標記，放入-20 ℃冰箱中冰置30 min沉淀DNA。然后，12 000 rpm離心10 min，倒掉上清液。將離心管倒扣在吸水紙上，放置4 h使殘余的異丙醇揮發后，在離心管中加入200 μL ddH2O，室溫溶解4 h后，隨機選擇10個DNA樣品利用Nano Drop 2000檢測DNA樣品的濃度和純度，將檢測合格的DNA樣品儲存于-20 ℃備用（樣品DNA的OD260/OD280值在1.8左右）。

1.3.2? ?測序

將用硅膠干燥的葉片（合格樣品）送至諾和生物進行測序。采用Illumina測序方法，該公司會返回原始數據（Raw data）與進行質控過濾后的數據（二代測序數據，Clean data），其后基于Clean data對其進行葉綠體基因組的組裝。

1.3.3? ?數據采集

在iPlant植物智挑選獲得獼猴桃屬19種、水東哥屬1種，再通過NCBI下載其完整葉綠體基因組序列（FASTA文件），同時挑選剛毛藤山柳作為外類群。

1.3.4? ?葉綠體基因組的組裝和注釋

采用葉綠體基因組組裝軟件（NOVOPlasty v3.1）[9]組裝完整的葉綠體基因組。所得的單個文件碎片整理程序（contigs）被鑒定并定位到參考基因組中華獼猴桃（Actinidia chinensis）（NC026690）進行進一步核查。通過CpGAVAS2[10]和GeSeq[11]對組裝的葉綠體基因組進行注釋。使用生物信息學軟件（Geneious v.9.0.2）[12]對起始和終止密碼子進行手動校正。將正確無誤的葡萄葉獼猴桃的完整葉綠體基因組序列提交至GenBank（MW420603）。

1.3.5? ?系統發育分析方法

基于每個基因組的基因位置獲得基因順序數據，利用RAxML8.0構建最大似然系統發育樹（Maximum Likelihood estimator，ML），計算支持率時，將物種數據集計算1 000次重復[13]。

2? ?試驗結果

2.1? ?葡萄葉獼猴桃葉綠體基因組特征

葡萄葉獼猴桃葉綠體基因是一個典型的四方體結構，完整葉綠體基因組長度為150 878 bp，其中大單拷貝（LSC）區長度為82 020 bp，小單拷貝（SSC）區長度為17 563 bp，一對反向重復區（IRs）長度為2 547 bp，總GC含量為38.5%。葡萄葉獼猴桃的葉綠體基因組包括130個基因，其中包括83個蛋白質編碼基因、8個核糖體RNA（rRNA）基因和39個轉運RNA（tRNA）基因。

2.2? ?系統發育結果

為了確定葡萄葉獼猴桃的系統發育關系，采用獼猴桃屬完整葉綠體基因組（19個序列）、水東哥屬的水東哥（2個序列）和作為外類群的藤山柳屬剛毛藤山柳（1個序列）。系統發育樹結果如圖1，葡萄葉獼猴桃與水東哥為姊妹類群。

3? ?討論

葉綠體為光合作用必不可少而存在于所有藻類微生物和綠色植物細胞中，且具有基因組結構較穩定、遺傳物質相對獨立等較多優勢[14]，因此葉綠體基因組非常適合進化學和系統學研究。cpDNA在植物總DNA中的含量相當豐富，且具有多拷貝、分子量小和結構簡單的特點，易于提取和分析。植物葉綠體基因組全序列檢測結果可以為其提供廣泛且具體的分子信息，有利于特定基因的分離、鑒定、測定及構建物理圖譜[15-16]。

中國葡萄葉獼猴桃的分布區域非常狹窄，該物種已瀕臨滅絕，個體數量已不足1 000株。本研究采用Illumina測序及NOVOPlasty v3.1對葡萄葉獼猴桃的葉綠體全基因組進行測序，并以發表的中華獼猴桃序列為參考組裝出葡萄葉獼猴桃葉綠體基因組。與傳統方法相比，該方法操作較為簡單，不需要單獨分離葉綠體和cpDNA，只需提取植物葉片全基因組DNA進行測序。通過與參考基因組比較后，將得到的序列結果與參考基因組Blast對比，即可輕松找出有效的reads，再用相對應的軟件進行組裝，并對組裝結果進行補洞從而獲得完整的全葉綠體基因組。該方法不僅操作簡單、費用較低，而且提高了試驗的可行性。通過對葡萄葉獼猴桃葉綠體基因組進行測序并對其進行特征分析，共注釋得到130個基因，其中包括83個蛋白質編碼基因、8個rRNA基因和39個tRNA基因;蛋白編碼基因對應的密碼子偏好使用A/T堿基。

試驗結果為后期葡萄葉獼猴桃葉綠體分子標記的開發提供了充分的試驗資料和參考價值。對葡萄葉獼猴桃葉綠體基因組的研究，有助于更好地研究獼猴桃科的系統發育和生物地理學，同時有助于進一步開展獼猴桃科植物雜交種質鑒定和基于葉綠體DNA數據的群體遺傳學研究。

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