56 ℃ 30 min滅活對新型冠狀病毒抗體和生化免疫檢測結果的影響

郭旺源，湯 敏，史文元，譚 潭，魯 爽，胡 政，賀榮章，李 佳，羅迪賢，彭旭紅△

1.湖南省郴州市第一人民醫院，湖南郴州 423000；2.湖南省郴州市第二人民醫院，湖南郴州 423000

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)傳染力強，人群普遍易感，其引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)目前尚無針對特異性治療藥物。國家衛生健康委員會將COVID-19納入乙類傳染病，并按甲類傳染病進行預防和控制。由于COVID-19患者血液標本有大的傳染性，實驗室檢測人員存在職業暴露可能，給實驗室檢測人員帶來極大的心理壓力[1]。《新型冠狀病毒肺炎防控方案(第五版)》指出SARS-CoV-2在56 ℃ 30 min處理可被滅活[2]。本研究將探討56 ℃ 30 min滅活處理對SARS-CoV-2 IgM抗體和生化免疫檢測結果的影響，為降低實驗室傳播風險和保護實驗室檢測人員安全提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年2月11-18日在郴州市第一人民醫院和郴州市第二人民醫院住院的SARS-CoV-2感染者或疑似感染者血液標本54例，其中男34例、女20例，年齡2～74歲。納入標準：COVID-19診斷依據為《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)[3]，確診病例具備SARS-CoV-2病原學證據。本項研究通過郴州市第一人民醫院和郴州市第二人民醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象或家屬均知情并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 SARS-CoV-2 IgM抗體檢測采用北京熱景生物技術股份有限公司生產的膠體金快速檢測專用試劑；術前八項檢測使用蘇州新波全自動時間分辨熒光免疫分析儀(檢測儀器型號：EasyCuta MiNi)及廠家配套試劑，陰性和弱陽性質控使用北京康徹斯坦生產的第三方質控品；生化項目檢測采用西門子AVDIA 2400全自動生化分析儀及配套試劑檢測，高、中、低3個水平質控采用美國伯樂生產的第三方質控品；滅活采用江蘇榮華儀器制造有限公司生產的可調式恒溫水浴箱，型號為HH-W420。核酸提取試劑(圣湘生物定制)、SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(圣湘生物)、ABI7500熒光定量PCR儀(Thermofisher公司)用于SARS-CoV-2感染者的確診。

1.3方法 使用力因精準醫療產品(上海)有限公司的負壓真空分離膠采血管(黃帽管)同時采集血液標本兩管，各5 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，其中一管按《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第五版)》等相關防護規范要求進行未滅活前的相關指標檢測[2]，另一管離心后不揭蓋放置于56 ℃恒溫水浴箱溫育30 min滅活處理，再進行相同指標檢測。所有標本檢測嚴格按儀器和試劑說明書進行操作，當日當批次室內質控在控。SARS-CoV-2 IgM抗體按定性結果報告，術前八項[乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)、乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)、丙型肝炎病毒抗體(HCV-Ab)、艾滋病病毒抗體(HIV-Ab)和梅毒抗體(TP-Ab)]、電解質、肝功能、腎功能、血糖、血脂和心肌酶結果按定量結果報告。結果分為未滅活組和滅活后組進行統計分析。

1.4統計學處理 采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。不符合正態分布的計量資料采用M(P25～P75)表示，組間比較采用自身配對樣本非參數檢驗(Wilcoxon 符號秩和檢驗)。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1滅活處理前后血清SARS-CoV-2 IgM抗體結果 54例患者中，經咽拭子核酸檢測陽性并經臨床確診的病例有20例，對54例患者血液標本56 ℃ 30 min滅活處理前后的血清SARS-CoV-2 IgM抗體進行檢測，結果顯示54例患者血標本中，滅活前檢出陽性26例，陰性28例，滅活后僅3例陽性標本轉為了弱陽性，滅活前后血清SARS-CoV-2 IgM抗體檢測結果差異無統計學意義(P>0.05)，血清SARS-CoV-2 IgM抗體檢測結果完全一致性達94.4%(51/54)。

2.2滅活處理前后術前八項結果 對患者血液標本56 ℃ 30 min滅活處理前后采用時間分辨免疫熒光法進行血清術前八項(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、HCV-Ab、HIV-Ab和TP-Ab)檢測，發現術前八項檢測結果在滅活處理前后差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 滅活處理前后術前八項結果比較[M(P25～P75)]

組別HBcAb(PEI U/mL)HCV-Ab(S/CO)HIV-Ab(S/CO)TP-Ab(S/CO)未滅活組7.710(0.659～9.120)0.232(0.225～0.246)0.157(0.146～0.166)0.064(0.052～0.069)滅活后組7.235(0.680～8.094)0.237(0.226～0.252)0.152(0.135～0.171)0.060(0.054～0.066)Z-1.381-1.008-0.406-0.049P0.1670.3130.6850.961

2.3滅活處理前后血清常規生化結果 對54例患者血液標本56 ℃ 30 min滅活處理前后的血清標本進行常規生化檢測，發現滅活處理前后電解質、肝功能、腎功能、血糖、血脂和心肌酶檢測結果中，肝功能中的丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉移酶(GGT)項目結果在滅活處理前后差異有統計學意義(P<0.05)，心肌酶檢測中的肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌紅蛋白(Mb)水平在滅活處理前后差異有統計學意義(P<0.05)，其余項目未發現滅活處理前后差異有統計學意義(P>0.05)。見表2～6。

表2 滅活處理前后血清電解質檢測結果比較[M(P25～P75)]

表3 滅活處理前后血清肝功能檢測結果比較[M(P25～P75)]

組別天門冬氨酸氨基轉移酶(U/L)膽汁酸(μmol/L)ALP(U/L)GGT(U/L)未滅活組29.30(20.98～43.65)3.00(1.80～11.90)80.80(61.65～99.60)66.45(35.80～181.50)滅活后組23.60(19.68～36.83)2.70(1.60～12.40)0.05(0.00～1.47)37.90(15.30～77.80)Z-1.813-0.194-6.321-3.308P0.070.846<0.0010.001

表4 滅活處理前后血清腎功能檢測結果比較[M(P25～P75)]

表5 滅活處理前后血清血糖和血脂檢測結果比較[M(P25～P75)]

表6 滅活處理前后血清常規心肌酶檢測結果比較[M(P25～P75)]

3 討 論

對COVID-19最有效的防控手段就是早發現，早診斷，早隔離，早治療[4-5]。《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》(以下簡稱方案)指出經呼吸道飛沫和密切接觸傳播是該病毒主要的傳播途徑。在相對封閉的環境中長時間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經氣溶膠傳播的可能[3]。《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第四版)》要求，未經培養的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進行的病毒抗原檢測、血清學檢測、核酸檢測、生化分析等操作，應在生物安全二級實驗室操作，但個人防護裝備參照生物安全三級實驗室的防護要求[2]。目前所見傳染源主要是SARS-CoV-2感染的患者，無癥狀感染者也可能成為傳染源。所以臨床實驗室人員在未經檢測前無法預知該標本是否具有潛在傳染性，檢測過程勢必造成嚴重的心理壓力[1,6]。

同時方案中指出：“對冠狀病毒理化特性的認識多來自對SARS-CoV 和MERS-CoV的研究。病毒對紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，氯己定不能有效滅活病毒。”可見SARS-CoV-2對各種脂溶劑類消毒劑敏感，但因乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑消毒劑對各種檢驗項目的檢測均有一定的影響而很少被采用[7]；紫外線常用于空氣和物體表面的消毒，對容器內的血液標本因穿透性和消毒效果有限，也限制了其使用[8]。本研究結合該病毒的理化特性和對臨床實驗室存在的潛在傳染風險情況，對血液標本在常規檢測前先將其離心分離后在未開蓋情況下放置56 ℃環境溫育30 min進行病毒滅活處理，達到降低生物安全風險目的，比較滅活處理前后常見項目的檢測結果。

研究中選取的54例研究對象中，經咽拭子核酸檢測陽性并經臨床確診的病例有20例，對54例患者的血液標本經56 ℃ 30 min滅活處理前后的血清SARS-CoV-2 IgM抗體進行檢測，結果54例患者血標本中，滅活前檢出陽性26例，陰性28例，滅活后僅3例陽性標本轉為了弱陽性，滅活前后血清SARS-CoV-2 IgM結果完全一致性達94.4%(51/54)。術前八項檢測在滅活前后結果差異無統計學意義(P>0.05)。在滅活處理前后電解質、肝功能、腎功能、血糖、血脂和心肌酶等生化結果的比較中發現，ALT、ALP、GGT、CK、CK-MB、LDH和Mb在血清病毒滅活后的檢驗結果明顯低于滅活前，滅活處理前后差異有統計學意義(P<0.05)，這可能是ALT、ALP、GGT、CK、CK-MB、LDH、Mb屬于不耐熱酶類，在加熱至56 ℃、30 min滅活處理過程中使其部分失去了酶活性而致檢測結果明顯降低[9-11]。故ALT、ALP、GGT、CK、CK-MB、LDH、Mb等不耐熱酶類的項目檢驗不適用于檢測前血清56 ℃ 30 min滅活處理。

綜上所述，對SARS-CoV-2感染者或疑似感染者血液標本在常規檢測前可先將離心分離后的標本在未開蓋情況下放置56 ℃環境30 min進行病毒滅活處理，對SARS-CoV-2 IgM抗體、術前八項等免疫感染類抗原抗體和多數生化常規檢測結果不會有太大影響，但該方法不能用于ALT、ALP、GGT、CK、CK-MB、LDH、Mb等不耐熱酶類項目的檢測前處理。56 ℃ 30 min病毒滅活法不需要昂貴的設備，使用實驗室常見的可調式恒溫水浴箱，操作簡單、易行，可考慮作為COVID-19疫情期間臨床實驗室工作人員預防職業暴露的一種切實可行的標本前處理方法，從而可有效降低醫源性感染SARS-CoV-2風險和實驗室工作人員的心理壓力及恐懼感。此研究為降低實驗室傳播風險和保護實驗室檢測人員安全提供數據參考。