青少年肥胖非酒精性脂肪肝患者血清外泌體源性miRNA表達譜的初步研究*

章建偉，吳若雅，潘海滔

浙江省紹興市婦幼保健院兒保科，浙江紹興 312000

非酒精性脂肪肝(NAFLD)為除飲酒和其他病理因素外引起過多脂肪在肝臟堆積導致的慢性疾病，是常見的慢性肝病[1]，容易發生在肥胖患者中，可增加心血管病的發生率[2]。據報道，65%～85%的肥胖患者易發生NAFLD[3]，其機制尚未完全了解。近年來，研究發現外泌體微小RNA(miRNA)在NAFLD發病機制中發揮重要作用[4]。外泌體是一種運載miRNAs 等重要分子的微小囊泡，發揮細胞間聯絡作用。肝臟細胞，尤其是肝細胞和膽管上皮細胞，既可釋放外泌體，又是肝臟內源性外泌體和其他器官細胞來源的外泌體作用的靶細胞。miRNAs為非編碼單鏈RNA分子，參與脂肪細胞分化、肝臟脂肪酸和膽固醇代謝、胰島素抵抗、線粒體損傷等過程的調節。有研究發現小鼠脂肪組織巨噬細胞的外泌體miRNAs可以增加胰島素抵抗[5]。另一項研究也表明外泌體miRNAs可作為病毒性肝炎、酒精性脂肪肝、NAFLD和肝細胞癌的潛在生物標記物，外泌體miRNAs或蛋白的表達隨著NAFLD的進展改變[6]。因此監測外泌體miRNAs對探索NAFLD的發病機制具有重要意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 經紹興市婦幼保健院倫理委員會批準，收集2019年7-12月來本院兒童內分泌科就診并收住入院的NAFLD患者5例(男3例，女2例)作為NAFLD組，根據性別、年齡配對5例單純肥胖患者作為對照組。本研究獲得受試者家屬知情同意并簽署知情同意書。10例研究對象年齡10～13歲。青少年NAFLD的診斷標準：參照中華醫學會兒科分會內分泌學組于2018年發布的專家共識[7]中彩色超聲診斷標準。肥胖判斷體質量指數(BMI)標準基于中國兒童的生長發育標準[8]。

1.2方法 所有患者均為住院患者，均于上午7點采集外周血5 mL，提取血清。采用外泌體提取試劑盒提取法提取外泌體，試劑盒由SBI公司提供。對提取的外泌體使用總RNA提取法提取總RNA，用微量核酸蛋白濃度測定儀(美國Thermo公司)測定標本總RNA濃度和純度。miRNA表達譜測序在每個標本總RNA的3′端和5′端添加RNA 接頭，PCR富集8% PAGE膠片段分選，根據Qubit定量結果，按數據比例混合文庫，進行橋式PCR擴增，簇生長，在Illumina測序平臺(美國Illumina公司)進行 2×150 bp測序。計算兩組樣品間各miRNA 的差異倍數，把當倍值設定1.5倍作為區別兩組間差異表達閾值，篩選當倍比值>2.0且P<0.05的差異性miRNA。測序過程由上海英拜生物科技有限公司完成。實時熒光定量PCR對顯著差異表達miRNA進行驗證。通過TargetScan、miRDB、miRanda靶基因預測軟件，對差異表達miRNA進行靶基因預測。應用DAVID數據庫對預測的靶基因進行GO功能富集分析。利用超幾何分布方法進行統計分析，計算出最為顯著的功能，并以P<0.05作為顯著富集基因的閾值。

2 結 果

2.1miRNA 表達譜結果通過高通量測序 成功構建NAFLD組和對照組血清外泌體源性miRNA 表達譜，共篩選出表達差異較高(>1.5倍)的已知miRNA30種，見表1。其中5種miRNA(miR-122-5p，miR-3591-3p，miR-335-5p，let-7g-3p和miR-27a-5p)較對照組差異表達且顯著升高2.0倍以上，4種miRNA(miR-6753-3p，miR-129-2-3p，miR-6760-5p，miR-6516)較對照組差異表達且顯著降低2.0倍以上，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表2。

2.2顯著差異表達miRNA的實時熒光定量PCR驗證 為驗證高通量測序結果的準確性，選取3個miRNA(miR-122-5p、miR-335-5p、miR-27a-5p)在兩組標本中進行驗證，兩組標本中miRNA的實時熒光定量PCR結果與高通量測序結果一致，見圖1。

2.3預測的靶基因及其GO功能富集分析 預測的差異表達miRNA的靶基因的生物學功能比較廣泛，包括葡萄糖穩態、脂質代謝、肝臟發育。大多數顯著富集的GO過程集中于調節葡萄糖穩態、脂質代謝、肝臟發育等病理生理功能，見表3。以P<0.05為顯著富集基因的閾值。

表1 30種差異表達的miRNA

表2 NAFLD組較對照組顯著差異表達的miRNA

圖1 miR-122-5p、miR-335-5p、miR-27a-5p在不同組別的表達驗證

表3 差異表達的miRNA預測的靶基因GO功能富集分析

3 討 論

青少年NAFLD發病率較高，達3%～10%，成年后并發癥較多，如肝硬化、2型糖尿病、代謝綜合征和心血管疾病等。青少年NAFLD發生機制尚不明確，“多次打擊”學說被大多數學者推薦[9]，包括高胰島素血癥和胰島素抵抗引起單純肝臟細胞脂肪變性，游離脂肪酸脂毒性作用、氧化應激、線粒體功能障礙等激活相關炎性細胞因子致肝細胞壞死，引起非酒精性脂肪性肝炎，激活肝星狀細胞合成大量細胞外基質進一步發生肝纖維化。miRNAs作為一種基因表達的調控因子，在肥胖、NAFLD、動脈粥樣硬化和糖尿病等代謝疾病的發生、發展中起重要作用，在肝臟疾病中作用更為明顯。已有眾多研究提示miRNAs 參與NAFLD病理生理的調控[10-11]，主要表現在脂肪細胞分化、肝臟脂肪酸和膽固醇代謝、胰島素抵抗、線粒體損傷等過程的調控。外泌體是一種細胞特殊小分子如miRNA的運輸載體，肝臟細胞既可釋放外泌體，又是肝臟內源性外泌體和其他器官細胞來源的外泌體作用的靶細胞。

miR-122是肝臟中表達量最豐富的miRNA，參與三酰甘油、膽固醇、游離脂肪酸的代謝。普遍認為，miR-122與脂肪肝發病密切相關。本項目中筆者發現NAFLD患者血清外泌體源性miR-122-5p表達顯著增加。SALVOZA等[12]也發現NAFLD 患者的血清miR-122水平明顯高于健康對照組，而CSAK等[13]在飲食誘導的脂肪性肝炎大鼠中發現肝臟組織miR-122降低。因此，本研究推測肝臟組織miR-122表達降低參與了非酒精性脂肪性肝炎相關肝纖維化的發生，其他組織分泌miR-122，并由外泌體攜帶至肝臟代償以保護肝臟。

miR-27是一種與脂質代謝相關性最高的miRNA。有研究表明在人類和嚙齒類動物脂肪細胞脂質代謝中miR-27a過度表達可以加速脂肪釋放、三酰甘油水解，釋放出更多的游離脂肪酸，肝臟游離脂肪酸的超負荷是導致脂肪肝變性的重要原因[14]。研究證實miR-27基因家族在成脂分化過程中表達下調，過表達miR-27會特異性抑制脂肪細胞的形成，而不影響肌源性分化[15]。此外，還發現miR-27可與過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)結合并影響其表達，調節脂質分解以及合成代謝效率，miR-27a可能在肥胖NAFLD的病理發展中發揮作用。此外，有研究發現，miR-335在肥胖小鼠的白色脂肪組織和肝臟中表達上調，這可能與肥胖的病理生理機制相關[16]。在飲食誘導小鼠NAFLD的肝臟中發現miR-335-5p上調，而miR-21有所降低，這些miR-335的靶標分子在調控脂類和碳水化合物代謝、信號傳導以及凋亡中都有重要作用，這對飲食引起肥胖、脂肪肝、肝纖維化甚至肝硬化的發生、發展具有重要作用[17]。

綜上所述，青少年NAFLD患者血清差異性表達的miRNA可能與疾病的發病機制有關，但仍需深入研究，miR-122-5p、miR-335-5p、miR-27a-5p可能可以作為肥胖NAFLD早期診斷的標記物。