高效液相色譜熒光及二極管陣列檢測器檢測血清中維生素A、E的方法學比較

賈永娟，劉杏立，雒 琴，王小蘭，倪君君

北京和合醫學診斷技術股份有限公司，北京 100011

維生素A(VA)和維生素E(VE)都屬于脂溶性維生素，是維持人體正常生理功能所必需的營養物質，且不能在人體內合成，需從食物中獲取[1-2]。VA具有促進生長發育、增強抵抗力、預防夜盲癥以及癌癥等作用，且對骨骼牙齒的發育和皮膚的光滑程度有著重要影響[3]；VE具有抗衰老、護膚以及抑制腫瘤等功效，并對習慣性流產、動脈粥樣硬化等起到預防作用[4]。但是體內VA、VE水平過高或過低均不利于身體健康[5-6]。因此，開發用于檢測血清中VA、VE水平的快速、高效的方法對及時調節體內VA、VE水平是十分必要的。

近年來，VA、VE的檢測方法主要有分光光度法[7]、氣相色譜法[8]、液相色譜法[1,9-10]和質譜法[11-12]等。其中，高效液相色譜法以靈敏度高、操作簡單、設備便宜易推廣的優勢已成為檢測VA、VE的主要方法。高效液相色譜法檢測又分為二極管陣列檢測器(DAD)檢測法和熒光檢測器(FLD)檢測法，但是鮮有報道對兩種方法進行詳細對比。本研究分別用這兩種檢測器(DAD、FLD)對血清中的VA、VE進行檢測，并在線性關系、精密度、準確度等方面進行比較，結果發現兩種檢測器均適用于檢測人血清中VA、VE水平，檢測結果無明顯差異，現報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器 高效液相色譜儀、熒光檢測器、二極管陣列檢測器(日本島津儀器有限公司)，紫外分光光度計[尤尼柯(上海)儀器有限公司]，多管渦旋混合器(北京踏錦科技有限公司)，離心機(Sigma公司)，氮氣吹掃儀(杭州奧盛儀器股份有限公司)。

1.2試劑 VA、VE標準品(Sigma公司)，VA、VE乙酯(Sigma公司)，蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)，無水乙醇(天津市光復精細化工研究所)，正己烷(北京頤豐天成科技有限公司)，甲醇(默克股份有限公司)。

1.3色譜條件 熒光檢測器的色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8 (2.1 mm×50.0 mm，5 μm)，流動相為甲醇/水，流速1 mL/min。熒光檢測器檢測VA和VE的激發和發射波長分別為325、294 nm 和470、328 nm。二極管檢測器的色譜柱為Waters SunFireTMC18 (2.1 mm×100.0 mm，3.5 μm)，流動相為甲醇/水，流速0.3 mL/min，檢測VA和VE的波長分別為325 nm和292 nm。

1.4血清標本預處理 將100 μL血清及其內標溶液置于1.5 mL的離心管中，加入100 μL蒸餾水稀釋，渦旋；再依次加入無水乙醇、正己烷，渦旋，離心；取上清液并吹干，加入100 μL甲醇復溶，渦旋溶解；放入棕色瓶中備用。

1.5方法學比較

1.5.1線性關系 配制系列水平的VA和VE標準品溶液，分別用FLD和DAD進行色譜分析，建立標準曲線。

1.5.2精密度 取適量配制好的供試品溶液，連續進樣6次，再分別用DAD和FLD進行檢測分析。

1.5.3回收率 在血清標本中添加3種水平(VA 0.125、0.5、2.0 mg/L，VE 1.25、5.0、20.0 mg/L)的標準溶液(簡稱加標)，按照血清標本預處理步驟進行回收試驗，空白對照標本及每個水平加標標本重復3次，并分別用FLD和DAD進行檢測。

1.5.4殘留 取高水平的供試品溶液，用FLD和DAD進行檢測分析；分析結束后，再對一份空白溶劑(甲醇)進行檢測。

1.5.5DAD和FLD的一致性和相關性 取正常16份血清進行預處理制備供試品溶液，并用FLD和DAD進行檢測，釆用Medcalc18.5統計學軟件，使用Bland-Altman點圖法分析FLD、DAD兩種檢測方法的一致性；Passing-Bablok回歸法分析相關性。

1.6統計學處理 釆用Medcalc18.5統計學軟件，使用Bland-Altman點圖法分析FLD、DAD兩種檢測方法的一致性；Passing-Bablok回歸法分析相關性。

2 結 果

2.1線性關系 建立的標準曲線結果如表1所示，線性相關系數(r)在0.999以上。

表1 FLD和DAD檢測血清中VA、VE的線性方程

2.2精密度 供試品溶液連續進樣6次，結果如表2所示：FLD、DAD檢測時，VA的相對標準偏差(RSD)為0.18%、0.91%；VE 的RSD為1.19%、0.49%。

表2 FLD和DAD檢測血清中 VA、VE的精密度

2.3回收率 空白標本和3種加標水平標本的檢測結果如表3所示：FLD檢測法的回收率為89.9%～104.7%，RSD≤3.60%；DAD檢測法的回收率為91.7%～103.2%，RSD≤2.91%。

表3 FLD和DAD檢測VA、VE的加標回收分析

續表3 FLD和DAD檢測VA、VE的加標回收分析結果

2.4殘留 殘留的考察結果顯示，目標分析物在色譜圖的相應保留時間處均未出現目標峰。

Passing-Bablok回歸法分析結果如圖2和圖3：VA的回歸直線方程為Y=-0.006 723 +0.970 2X，斜率B為 0.970 2(95%CI:0.913 5～1.045 3)，截距A為-0.006 723(95%CI:-0.042 05～0.026 16),P=0.49。VE的回歸直線方程為Y=-0.489 6+0.992 4X，斜率B為0.992 4(95%CI:0.940 1～1.049 5)，截距A為-0.489 6 (95%CI:-1.329 5～0.203 1)，P=0.49。由此結果可得：VA、VE回歸直線的斜率95%CI均包含1，截距的95%CI均包含0，P>0.05。

表4 FLD和DAD檢測16份血清中VA、VE水平的實驗數據(mg/L)

注：A為FLD圖，B為DAD圖。

注：A為Bland Altman點圖，B為Passing-Bablok圖。

注：A為Bland Altman點圖，B為Passing-Bablok圖。

3 討 論

VA、VE作為重要的脂溶性維生素，是人體所必需的微量營養物質。正常情況下，健康人群血清中VA 水平為0.30～0.36 mg/L，VE水平為5.0～20.0 mg/L，兒童血清中的VE水平稍低，平均為(5.3±1.3)mg/L[4]。近年來，越來越多的研究表明，VA的缺乏和水平降低會增加嬰幼兒常見哮喘性疾病發生的風險[13]；VA、VE水平對孕婦和胎兒的健康起著至關重要的影響[14]。因此，人體內VA、VE水平的檢測對預防嬰幼兒疾病以及孕婦的營養指導等具有一定的臨床意義。

目前，VA、VE的檢測方法已有10余種。比色法：通過顯色反應定量，簡單、快速，但顯色不穩定且干擾大，現已不常用；分光光度法：作為過去常用的方法，成本低、設備簡單、易推廣，但只能測定總含量，不能定量各同分異構體及其同系物，選擇性差；熒光法：根據熒光強度定量，特異性強、干擾少、靈敏快速簡單，但測定值與總VE值有偏差，更適用于檢測以α-VE為主體的標本；電化學法、色譜法：快速、靈敏、高效，現已成為常用的分析手段。而色譜法中的高效液相色譜法已成為VA、VE檢測的主流，其突出特點：(1)快速、高效，可同時分離包括同分異構體在內的多種化合物；(2)靈敏、特異性強，可用FLD、DAD等；(3)操作簡單、快速。

因此，本文建立了高效液相色譜法對血清中的VA、VE水平進行檢測，并將高效液相色譜法的FLD和DAD進行了對比，結果顯示：在考察范圍內，FLD和DAD的檢測結果均呈現出良好的線性關系，且表現出良好的精密度以及良好的相關性和一致性。所以兩種高效液相色譜法均適用于檢測血清中VA、VE水平。然而，從檢測色譜圖中可以看出，FLD比DAD分析時間短、專屬性強、基質干擾較少。因此，FLD更能滿足臨床標本周期短、批量檢測的要求，且節能、高效。