復方黃柏液涂劑對中波紫外線致HaCaT細胞急性光損傷的修復作用*

黃艷麗，錢麗潔，陳鳳娟，王 雄

上海交通大學附屬上海市第六人民醫院東院皮膚科，上海 201306

到達地球表面的紫外線包括UVA(320～400 nm)和UVB(290～320 nm)。雖然UVB只占0.5%，但在同等劑量下對皮膚的損傷量是UVA的1萬倍。紫外線輻射后急性皮膚光損傷包括日曬紅斑和黝黑反應，可有紅斑、水皰等表現。目前UVB所致急性皮膚光損傷具體機制不明確，研究認為氧化損傷起重要作用。防曬劑和抗氧化劑的協同使用是機體光防護的主要方法，天然抗氧化劑是近些年研究的熱點[1]。中藥提取物是天然抗氧化劑的重要來源，目前已有研究證實五味子、肉豆蔻、黃柏、黃芪、麥冬、金銀花、紅景天等具有抗皮膚光老化作用。復方黃柏液涂劑主要組分為黃柏、連翹、金銀花等中藥，有清熱燥濕、瀉火祛腐功用，臨床上適用于瘡潰瘍后、傷口感染等癥狀[2]。李慎新等[3]比較了幾種中草藥的抗氧化活性，發現黃柏和連翹抗氧化活性優于其他幾種中草藥。本研究旨在通過UVB照射建立永生化人表皮角質形成細胞(HaCaT細胞)急性光損傷模型，初步探討復方黃柏液涂劑是否有光防護作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 復方黃柏液涂劑(山東漢方制藥有限公司，國藥批號Z10950097)； HaCaT細胞(武漢大學中國典型培養物保藏中心)； CCK8(日本同仁公司)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過氧化物酶(CAT)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒及基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)試劑盒均購自碧云天生物科技；UVB光療儀(Sigma公司)；酶標儀(Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1HaCaT細胞培養 將含10%FBS的DMEM培養液加入HaCaT細胞培養瓶，在100%濕度、5% CO2、37 ℃的培養箱中培養。取3～8代對數生長期的HaCaT細胞，0.25%胰蛋白酶消化后傳代接種于96孔板上，密度約為105個/mL。

1.2.2復方黃柏液處理濃度 將復方黃柏液涂劑分別按1∶10、1∶30、1∶50、1∶100、1∶200稀釋加入HaCaT培養板，繼續培養24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h，在酶標儀上選擇450 nm波長處測定各孔的吸光度值，檢測波長450～490 nm，參比波長600～650 nm。

1.2.3實驗分組及HaCaT細胞急性光損傷模型建立 將培養的HaCaT細胞分為對照組、模型組、實驗組。對照組為正常培養的HaCaT細胞，不作任何處理。模型組HaCaT細胞接受不同劑量UVB照射，其中光療儀燈管距離培養板15 cm，UVB照射劑量分別為10、20、30 mJ/cm2，PBS覆蓋細胞上層，UVB照射結束后繼續培養[4]。實驗組HaCaT細胞采用1∶100稀釋復方黃柏液培養6 h，96孔板中HaCaT細胞達到95%融合時，然后接受10、20、30 mJ/cm2劑量UVB照射。

1.2.4觀察指標 (1)HaCaT細胞增殖率：各組HaCaT細胞培養24 h后，每孔加入10 μL CCK8溶液，繼續孵育4 h后，在酶標儀上選擇450 nm波長處測定各孔的吸光度值。(2)LDH、SOD及CAT水平：采用比色法測定，細胞培養24 h后收集上清液，依據LDH、SOD、CAT及MMP-1試劑盒說明書，計算各組LDH、SOD、CAT及MMP-1水平。

2 結 果

2.1UVB誘導HaCaT細胞急性光損傷模型 正常培養條件顯微鏡下HaCaT細胞表現為貼壁生長的不規則細胞，數量較多(圖1)，隨著UVB劑量增加，細胞開始變形，細胞碎片增多，細胞數量逐漸較少(圖2)。

圖1 正常培養條件下HaCaT細胞(×100)

圖2 30 mJ/cm2UVB照射下HaCaT細胞(×100)

2.2復方黃柏液處理濃度 CCK8法檢測結果表明，空白組細胞增殖率為(87.433±3.761)%，復方黃柏液稀釋組中1∶10組、1∶30組、1∶50組、1∶100組、1∶200組HaCaT細胞增殖率分別為(70.932±4.131)%、(74.597±4.822)%、(78.325±3.063)%、(85.875±3.314)%、(86.075±3.225)%。其中1∶10組、1∶30組、1∶50組HaCaT細胞增殖率顯著低于空白組(P<0.05)，復方黃柏液抑制HaCaT細胞增殖。1∶100組和1∶200組HaCaT細胞增殖率與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)，考慮復方黃柏液的有效濃度，后續實驗采取的濃度為復方黃柏液按1∶100稀釋。

2.3各組上清液LDH、SOD、CAT水平及細胞增殖率 對照組中HaCaT細胞培養上清液LDH水平顯著低于模型組和實驗組，SOD、CAT水平及細胞增殖率顯著高于模型組和實驗組。實驗組和模型組中隨著UVB劑量逐漸增加，HaCaT細胞培養上清液LDH水平顯著提高，SOD、CAT水平及細胞增殖率顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。同一UVB劑量下，模型組LDH水平顯著高于實驗組，SOD、CAT水平及細胞增殖率顯著低于實驗組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同UVAB劑量下各組HaCaT細胞培養上清液LDH、SOD、CAT水平及細胞增殖率的比較

2.4各組上清液MMP-1水平 在同一UVB劑量下，實驗組HaCaT細胞MMP-1水平比模型組明顯減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。UVB照射的實驗組和模型組HaCaT細胞培養上清液MMP-1水平均高于對照組[(5.763±0.592)ng/mL]，差異均有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組HaCaT細胞培養上清液MMP-1水平

3 討 論

皮膚是人體最大的器官，具有屏障作用和免疫功能，是防御各種物理性、化學性損傷的第一道防線。皮膚光損傷不僅影響皮膚美觀，還與多形性日光疹、慢性光化性皮炎、日光性蕁麻疹、皮膚癌等疾病相關，容易對人們生活質量造成負面影響，因此如何更好地預防光損傷一直是皮膚研究領域的熱點。UVB輻射引起的皮膚急性光損傷機制主要包括細胞凋亡、氧化應激、脂質蛋白作用、DNA損傷修復、線粒體損傷，其中氧化應激起重要作用。UVB輻射導致大量活性氧簇(ROS)產生，激活氧化應激通道，調控炎癥因子及抗氧化物酶等表達。清除ROS，維持ROS與抗氧化酶動態平衡，減輕氧化應激損傷[5]。此外，光損傷可造成皮膚膠原降解，基質金屬蛋白酶(MMPs)是調節膠原降解的重要因素。MMP-1為MMPs家族中降解膠原蛋白活性最高的酶，UVB照射可以誘導HaCaT分泌MMP-1增多[6]。角質形成細胞為皮膚吸收UVB的主要細胞，HaCaT細胞是人皮膚良性角質形成細胞的永生化細胞株，常用于替代表皮角質形成細胞做體外實驗研究。研究發現姜黃素、茶多酚、補骨脂素、枸杞多糖等中藥提取物能提高機體抗氧化能力，防御HaCaT細胞光老化[7-9]，對中藥抗皮膚氧化的研究可擴展天然抗氧化劑的選擇范圍。

SOD及CAT作為重要的抗氧化物質，可減少細胞內氧化應激產物及活性氧的產生。而紫外線可抑制抗氧化酶活性，過量的活性氧使細胞膜的脂質雙層結構氧化，提高細胞膜通透性，細胞內LDH可通過細胞膜滲出到上清液中，血清LDH水平是反映HaCaT細胞膜氧化損傷程度的重要標志。本研究結果顯示，在同一組別中，隨著UVB劑量增加，LDH水平顯著升高，SOD、CAT及細胞增殖率顯著降低，這與此前研究結果類似[5]，細胞氧化損傷程度與UVB劑量相關。本研究也發現在同一劑量UVB照射下，相比模型組，復方黃柏液顯著降低SOD、CAT水平及細胞增殖率，提高LDH水平，說明復方黃柏液可顯著提高HaCaT細胞抗氧化能力，減輕細胞膜氧化應激損傷，進而提高細胞增殖率。本次實驗中發現，UVB照射組與對照組比較，MMP-1表達顯著增多，在同一UVB劑量下實驗組HaCaT細胞MMP-1水平比模型組明顯減少，說明復方黃柏液可以抑制UVB誘導的MMP-1分泌，減少UVB對組織的損傷，但對其具體信號通道作用仍需進一步研究。

復方黃柏液中黃柏和連翹為君藥，金銀花、蒲公英為臣藥，具有清熱瀉火、消腫祛腐功效。有研究發現黃柏中黃酮類化合物含量豐富，可清除自由基和超氧陰離子，具有較強的抗氧化作用[10-11]。連翹提取物中的總黃酮、綠原酸、連翹酯苷、蘆丁等具有抗氧化抗衰老等作用[12]。金銀花、蒲公英中也有多種抗氧化活性分子，包括綠原酸、黃酮、揮發油等[13-14]，二者均可吸收紫外線，具有較強的防曬能力。所以復方黃柏液可能通過上述抗氧化分子對HaCaT細胞進行光防護作用。

本次研究初步發現復方黃柏液可能對UVB照射HaCaT細胞造成的急性光損傷具有防護作用，但對具體細胞信號通路作用未明確，之后將對炎癥細胞因子及細胞衰老凋亡相關蛋白等進行進一步研究。復方黃柏液在皮膚應用范圍較廣，對濕疹、接觸性皮炎、脂溢性皮炎、帶狀皰疹、中毒性表皮松解癥具有顯著效果[15-16]，對皮膚無明顯刺激作用，安全性高，可進行更多的研究，使其更好地用于臨床工作中。