孕前保健男性年齡與精子DNA碎片、精液常規參數的相關性分析*

庾偉堅，路瑞靜，江 凡，陳 獻，梁淑馨，胡 蝶，周喜友

廣東省深圳市寶安區婦幼保健院檢驗科，廣東深圳 518102

研究顯示，生殖健康已成為世界性問題，約影響20%的育齡期家庭[1-2]，其中男性因素單獨占1/3[3]。眾所周知，男性年齡>35歲或是>40歲被認為是高齡，并可直接影響妊娠結局。隨著年齡的增加，男性在性激素水平、氧壓力、體細胞突變、感染等方面面臨更大的選擇性壓力進而延長備孕時間，嚴重的可導致體外胚胎植入失敗，甚至影響新生命的健康[4-6]。目前臨床評估男性生殖能力主要依賴傳統的描述性的精液常規檢查參數，包括精液體積，精子數量、形態、活力、存活率等，但因無法準確衡量男性生育能力的高低而制約其臨床應用。

精子DNA碎片指數(DFI)可衡量精子核DNA結構完整性，是影響胚胎完整發育的關鍵因素。當精子DNA結構受損時，可影響妊娠結局，例如復發性流產[7]；因此，DFI可成為新的評估精子質量和預測生育結局的臨床指標。本研究旨在探討年齡與精子DNA結構完整性以及傳統精液常規各項參數之間的臨床關聯性，為臨床全面客觀評估男性生育力提供相關依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年5月至2019年6月在深圳市寶安區婦幼保健院生殖健康科進行孕前保健檢查的男性1 237例，年齡21～58歲。排除患有腫瘤、無精子癥、精索靜脈曲張、配偶不良孕產史、隱睪癥等男性患者。依據年齡截點分為3組，分別為20～29歲、30～39歲和≥40歲。

1.2方法

1.2.1精液標本獲取 就診男性禁欲2～7 d，采用手淫法獲取精液標本置于無菌取精杯中迅速運送至精液分析實驗室。

1.2.2精液常規參數分析 將精液標本置于37 ℃恒溫水浴箱中振蕩液化30 min，液化完全后進行精液常規檢驗。采用計算機輔助精子分析系統(CASA)分析獲取精液常規各項參數。

1.2.3精子形態參數分析 吸取20 μL混勻的精液標本制作2張精子涂片，采用Diff-Quik (BioMart,深圳,中國)快速染液進行染色。200倍鏡下觀察精子形態，并連續計數200個精子，計算精子正常形態百分率、精子頭部畸形數。

1.2.4精子DFI分析 利用SCSA方法結合流式細胞術檢測精子DFI和精子成熟度。檢測試劑盒為精子核完整性染色試劑盒(珠海安達圣物科技有限公司，珠海，中國)。流式細胞術至少計數5 000條精子為有效數據。

1.3統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件進行整理分析，呈偏態分布的計量資料以中位數(M)和四分位數(P25～P75)表示，3組間比較采用非參數Kruskal-Wallis檢驗，并同時進行組間兩兩分析；相關分析采用Spearman分析，采用多因素Logistic回歸分析各精液參數間的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1精液常規參數一般情況 如表1所示，≥40歲男性的前向運動精子百分率、精子存活率與20～29歲男性相比，差異均有統計學意義(P<0.05);≥40歲男性的前向運動精子百分率、精子存活率、精液體積、不動精子百分率與30～39歲男性相比，差異均有統計學意義(P<0.05)。其中隨著孕前保健男性年齡的增加，前向運動精子百分率、精子存活率顯著降低(P<0.05)。正常形態精子百分率、精子濃度、精子總數、精子成熟度、禁欲天數、精液pH、非前向運動精子百分率及頭部畸形精子百分率等精液臨床參數在3組年齡男性中差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2年齡與精子DFI的相關關系 如圖1所示，相比20～29歲、30～39歲孕前保健男性群體，≥40歲男性精子DFI顯著增加(P<0.001，圖1A)；而20～29歲與30～39歲男性群體精子DFI差異無統計學意義(P>0.05；圖1A)。年齡與精子DFI存在正相關關系(r=0.11，P<0.000 1，圖1B)，表現在≥40歲男性相關關系更顯著(r=0.18,P<0.000 1，圖1E)，20～29歲和30～39歲男性群體年齡與精子DFI無相關關系(P>0.05，圖1C、1D)。

表1 基于年齡分組的精液臨床參數一般信息[M(P25～P75)]

注：A為精子DFI在20～29歲、30～39歲、≥40歲孕前保健男性群體之間的分布，兩組間比較，*P<0.001，**P<0.000 1；B為孕前保健男性群體精子DFI與其對應孕前保健男性年齡之間的關聯性；C為20～29歲孕前保健男性群體中年齡與其對應精子DFI的關聯性；D為30～39歲孕前保健男性群體精子DFI與其年齡的關聯性；E為≥40歲孕前保健男性群體精子DFI與其年齡的關聯性。

2.3精子DFI與其他精液臨床參數之間的相關性分析 精子DFI與正常精子形態百分率、精子濃度、前向運動精子百分率、精子存活率、非前向運動精子百分率呈負相關關系(r=-0.21、-0.11、-0.45、-0.45、-0.21，均P<0.05)；而與禁欲天數、精液體積、不動精子百分率、頭部畸形精子百分率呈顯著的正相關關系(r=0.14、0.13、0.46、0.21，均P<0.05)。與20～29歲男性群體相比，30～39歲及≥40歲男性在前向運動精子百分率、精子存活率、非前向運動精子百分率、不動精子百分率和頭部畸形精子百分率這5個精液參數中呈更強的相關關系。見表2。

表2 DFI與精液常規基于年齡分組相關性分析

續表2 DFI與精液常規基于年齡分組相關性分析

2.4多因素Logistic回歸分析精子DNA碎片的風險因素 如表3所示，應用多變量Logistic回歸分析顯示, 年齡、精液體積和不動精子百分率是精子DNA碎片的風險因素(OR=1.031、1.215、1.038)。正常形態精子百分率、前向運動精子百分率、精子成熟度和非前向運動精子百分率是精子DNA碎片的保護性因素(OR=0.912、0.011、0.966、0.968)。

表3 精子DNA碎片與年齡及精液臨床參數的多變量Logistics回歸分析

3 討 論

研究證實，年齡增加與精液質量呈負相關關系；年齡可影響性激素水平，增大機體氧化應激壓力，增加體細胞突變率，從而進一步影響男性生殖能力[8]。然而，有研究發現男方高齡對處于分裂期的受精卵和胚胎質量并無顯著影響[9]。另一項在415對夫妻試管嬰兒的研究中發現妊娠結局與男方高齡沒有顯著關聯[10]。因而，目前有關年齡影響男性生育能力的具體的細節性研究仍存在較大爭議，亟待更準確地研究評估年齡和男性生育能力之間的關系。

本研究主要闡述年齡對精液常規參數以及精子DNA結構完整性的影響。研究結果顯示，年齡的增加可顯著影響精子正常形態、前向運動精子百分率、精子存活率、精液體積、不動精子百分率以及頭部畸形精子百分率等傳統的描述性的精液常規參數。另外，隨著年齡的增加，精子DFI也呈顯著增加的態勢，且年齡與精子DFI呈正相關關系。這種正相關關系更加明顯地表現在≥40歲男性群體；年齡在40歲以下的男性群體，精子DFI變化與年齡并無顯著相關性。類似的研究結果在一項1 124例≥40歲的男性群體研究中也得到證實[8]。精子DFI是評估胚胎質量的一項關鍵指標，被廣泛應用于生殖實驗室，可直接反映精子DNA結構完整性程度，并與男性生殖能力緊密相關。研究表明不育男性的DFI顯著高于正常男性[11-12]，因此，本研究進一步分析了精子DFI與傳統精液常規參數的關聯性，結果發現精子DFI與部分描述性精液常規參數存在正相關或者負相關關系。更重要的是，本研究發現與20～29歲男性群體相比，30～39歲及≥40歲男性在前向運動精子百分率、精子存活率、非前向運動精子百分率、不動精子百分率和頭部畸形精子百分率這5個精液參數中呈更強的相關關系。為了消除一些混雜因素的影響，利用Logistic回歸分析精子DNA碎片的風險因素，結果證實年齡是精子DNA碎片的獨立危險因素。這些結果更進一步證實了年齡可一定程度上影響傳統的精液常規參數和精子DNA結構完整性，可為臨床生殖實驗室評估男性精液質量，特別是高齡男性生育能力提供可靠的證據。

迄今為止，有關年齡如何影響精液參數質與量的研究結論尚未完全明朗，存在多方面影響因素。一些研究顯示，由于年齡增加而致使體內活性氧(ROS)的增加、降低精子抗氧化保護屏障以及機體氧化應激反應引發的精子損傷等原因可降低精液質量合格程度[13-14]；類似的研究發現體內過量的ROS水平與精子DNA結構損害程度呈正相關關系。另外，有研究證實男性高齡可能會影響精子DNA結構受損時的結構重塑過程，從而致使精子染色質結構域組裝失敗并且嚴重降低其DNA片段修復能力[15-16]。這些研究可在一定程度上解釋了高齡男性對氧化應激攻擊的脆弱性，從而導致其生育能力低下。因此，后續需要更多的研究聚焦探索年齡影響精子DNA結構改變的其他機制，如生殖細胞突變等方面機制。由于回顧性分析的限制，本研究未能收集到其他地區以及不同生活環境的受試者信息以減少偏倚性，因而后續也需要不同地域的多中心的臨床和實驗室研究印證結果的準確性。