宮內(nèi)暴露于高雄激素對(duì)小鼠胎盤(pán)營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響*

王 鑫，陳書(shū)強(qiáng)，金 妮，董 杰，雷 輝，王曉紅

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710038

多囊卵巢綜合征(PCOS)是臨床上發(fā)生率較高的代謝、內(nèi)分泌疾病，以排卵障礙、高雄激素血癥為主要特征，表現(xiàn)為月經(jīng)周期不規(guī)律、不孕及多毛等[1-2]。臨床研究表明，PCOS病因復(fù)雜，多數(shù)患者發(fā)病是在多基因遺傳易感性基礎(chǔ)上形成，由各種不良環(huán)境因素誘發(fā)[3]。國(guó)外學(xué)者研究表明，機(jī)體生長(zhǎng)是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程，常受到激素的持續(xù)刺激，導(dǎo)致其生理、代謝異常[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，動(dòng)物娩出前持續(xù)暴露在高雄激素中，能引起胎兒產(chǎn)生雄激素化特征，能增加高雄激素血癥發(fā)生率[5]。胎盤(pán)是妊娠期特殊的器官，承擔(dān)了未成熟胎兒所有器官功能，但是胎盤(pán)較為脆弱，其功能發(fā)揮受到較多因素的影響[6-7]。胎盤(pán)特需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)水平下調(diào)，會(huì)影響胎兒宮內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)低出生體質(zhì)量[8]。因此，本研究以小鼠作為研究對(duì)象，探討宮內(nèi)暴露于高雄激素對(duì)小鼠胎盤(pán)營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇2018年1-3月購(gòu)置的6～8周齡ICR雌性小鼠,體質(zhì)量30～40 g,實(shí)驗(yàn)組7只，對(duì)照組6只，與雄鼠1∶1合籠，自然受孕，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(陜)2017-003。所選動(dòng)物均購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲水、進(jìn)食，自然光照，飼養(yǎng)溫度20～23 ℃，飼養(yǎng)環(huán)境濕度40%～60%。

1.2主要藥品與試劑 脫氫表雄酮(DHEA)購(gòu)自美國(guó)ApexBio公司；RNA 的抽提采用TRIzol試劑，購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑均購(gòu)自日本 TaKaRa 公司；PCR引物由中國(guó)上海生物工程有限公司合成。

1.3主要儀器與設(shè)備 PCR儀、CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MD SpectraMax公司；ND2000分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；高速離心機(jī)購(gòu)自北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司，超低溫冰箱購(gòu)自Beckman公司，水平電泳儀購(gòu)自北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.4方法

1.4.1干預(yù)方法 對(duì)照組：從孕6.5 d開(kāi)始每天經(jīng)頸部皮下注射單純玉米油0.2 mL。實(shí)驗(yàn)組：給予頸部皮下注射DHEA油劑(60 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)并均完成12.5 d干預(yù)，第18.5天干預(yù)完畢后以頸椎脫臼法處死，收集胎鼠及胎盤(pán)標(biāo)本。

1.4.2目的基因mRNA表達(dá)測(cè)定 (1)RNA的分離、提取：將胎盤(pán)轉(zhuǎn)入2 mL玻璃組織的勻漿器中，加入2 mLTRIzol試劑，充分混合均勻后室溫放置5 min，使其充分裂解，勻漿液分別移入2個(gè)1.5 mL EP管中，于4 ℃下高速離心機(jī)中12 000 r/min離心5 min，棄沉淀，留上清液。加入200 μL氯仿，振蕩混勻后室溫放置15 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，吸取上層水相，至另一離心管中；加入等體積的異丙醇(至少50 μL)，混勻，室溫放置5～10 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，RNA沉淀于管底；加入100 μL 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；4 ℃ 8 000×g 離心5 min，盡量棄去上清液，室溫晾干5 min(目測(cè)晾干)，其中一管用75%乙醇保存，另一管用30～50 μL 水溶解RNA樣品。(2)反轉(zhuǎn)錄：嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)體系要求以及反應(yīng)條件要求操作，每組標(biāo)本取 1 μL RNA標(biāo)本加至 20 μL體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為25 ℃ 10 min、42 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，4 ℃保存，從而獲得cDNA。(3)目的基因mRNA表達(dá)水平測(cè)定采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，引物序列為PrimerBank 上所查的序列，由上海生工生物工程有限公司合成，目的基因及內(nèi)參GAPDH的引物序列見(jiàn)表1。建立反應(yīng)體系如下：熒光染料SYBR Green Master Mix(2×)10 μL，滅菌蒸餾水6 μL，PCR 正向引物1 μL、反向引物1 μL，cDNA模板2 μL，總體積為20 μL。每份標(biāo)本均設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，取平均值。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，隨后95 ℃延伸15 s，95 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后記錄擴(kuò)增曲線和熔解曲線，以確定標(biāo)本擴(kuò)增的特異性。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線，得到每個(gè)標(biāo)本的循環(huán)閾值(Ct值)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.5觀察指標(biāo) (1)胎鼠存活率。記錄兩組胚胎總著床數(shù)、存活數(shù)、平均窩仔數(shù)及存活率。(2)胎鼠體質(zhì)量、胎盤(pán)質(zhì)量及胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)效率。記錄實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胎鼠體質(zhì)量、胎盤(pán)質(zhì)量及胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)效率[胎鼠出生體質(zhì)量(g)/胎盤(pán)質(zhì)量(g)]。(3)目的基因mRNA表達(dá)水平。記錄實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胎盤(pán)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平、胎盤(pán)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組胎鼠存活率比較 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胚胎總著床數(shù)、存活數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組平均窩仔數(shù)、存活率低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 目的基因及內(nèi)參GAPDH引物序列

表2 兩組胎鼠存活率比較

2.2兩組胎鼠體質(zhì)量、胎盤(pán)質(zhì)量及胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)效率比較 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)效率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組胎鼠體質(zhì)量、胎盤(pán)質(zhì)量均低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組胎鼠體質(zhì)量、胎盤(pán)質(zhì)量及胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)效率比較

2.3兩組胎盤(pán)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平比較 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩組胎盤(pán)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Slc2a1、Slc2a2、Slc2a3、Slc2a9、Slc2a12 mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.4兩組氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Slc38a1、Slc38a2、Slc38a4、Slc43a2、Slc7a5、Slc7a8 mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討 論

PCOS是一種病因較為復(fù)雜的婦科疾病，具有非遺傳理論與遺傳理論兩種[9]。非遺傳學(xué)理論認(rèn)為，妊娠期子宮內(nèi)激素會(huì)產(chǎn)生變化，引起內(nèi)分泌異常，而長(zhǎng)期暴露在高濃度雄激素環(huán)境下，增加排卵功能障礙發(fā)生率[10-11]。而遺傳學(xué)理論認(rèn)為，PCOS具有一定的遺傳史、家族史，高雄激素血癥和(或)高胰島素血癥均會(huì)增加PCOS的發(fā)生[12]。國(guó)外學(xué)者在一個(gè)經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證的 PCOS 綿羊模型中發(fā)現(xiàn)，除了成年期代謝和生殖疾病外，早期妊娠暴露于高雄激素可以導(dǎo)致雌性后代的出生體質(zhì)量偏低，胎盤(pán)供血不足是該模型中胎兒低出生體質(zhì)量發(fā)生的機(jī)制，這種現(xiàn)象是由雄激素作用介導(dǎo)的[13-14]。在人類(lèi)和動(dòng)物模型中，與不良的妊娠和分娩結(jié)果有關(guān)的胎盤(pán)機(jī)制包括胎盤(pán)氧化和氧化應(yīng)激、炎癥等，這些均能引起脂質(zhì)積聚，加速胎盤(pán)老化，但尚少見(jiàn)關(guān)于營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)是否受損的相關(guān)機(jī)制研究[11]。

國(guó)外學(xué)者研究表明，孕期暴露在高雄激素環(huán)境下能引起小鼠雌性后代出現(xiàn)男性化特征，而高雄激素血癥亦可引起外生殖器男性化[15-16]。由此看出，孕期宮內(nèi)暴露在高雄激素中能影響胎兒多個(gè)器官發(fā)育，增加胎兒起源的成人疾病綜合征。本研究中，實(shí)驗(yàn)組平均窩仔數(shù)、存活率低于對(duì)照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組胎鼠體質(zhì)量、胎盤(pán)質(zhì)量均低于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明宮內(nèi)暴露于高雄激素中會(huì)降低小鼠窩仔數(shù)、存活率，亦可降低胎鼠體質(zhì)量及胎盤(pán)質(zhì)量[17-18]。國(guó)外學(xué)者將接受體外受精-胚胎移植治療的460例患者作為研究對(duì)象，隨機(jī)分為PCOS組、僅多囊卵巢組(PCOM組)及卵巢形態(tài)正常的不孕組，結(jié)果表明，PCOS組的獲卵率、第二次減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞率及正常形態(tài)卵母細(xì)胞率明顯減少，卵母細(xì)胞形態(tài)異常增加，細(xì)胞質(zhì)量下降，導(dǎo)致胎兒出生體質(zhì)量下降。這主要是由于高雄激素環(huán)境能引起子宮內(nèi)膜功能異常，抑制機(jī)體性腺激素激動(dòng)，降低雄激素水平。同時(shí)，持續(xù)的高雄激素環(huán)境能引起機(jī)體肥胖、胰島素抵抗及代謝異常，導(dǎo)致產(chǎn)科并發(fā)癥、新生兒并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高。

葡萄糖是一種極性分子，很難以自由擴(kuò)散方式進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞主要通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式吸收葡萄糖，且大部分組織包括胎盤(pán)的細(xì)胞均需要通過(guò)鑲嵌在細(xì)胞膜上的載體蛋白質(zhì)——葡萄糖(GLUTs)介導(dǎo)的易化擴(kuò)散來(lái)攝入葡萄糖。葡萄糖屬于胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[19]。胎盤(pán)絨毛組織中芳香化酶能作用于雄激素中，引起轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)生變化，從而對(duì)小鼠胎盤(pán)營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體產(chǎn)生影響。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是膜蛋白的一大類(lèi)，介導(dǎo)生物膜內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)及信號(hào)交換。脂質(zhì)雙分子層在細(xì)胞或細(xì)胞器周?chē)纬梢坏朗杷琳希瑢⑵渑c周?chē)h(huán)境隔絕起來(lái)。盡管小分子能通過(guò)滲透方式通過(guò)細(xì)胞膜，但多數(shù)的親水化合物均需要特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白幫助通過(guò)疏水屏障。因此，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取、代謝產(chǎn)物釋放和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮了重要的作用。本研究中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩組胎盤(pán)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Slc2a1、Slc2a2、Slc2a3、Slc2a9、Slc2a12 mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)；兩組胎盤(pán)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平相比，實(shí)驗(yàn)組Slc38a1、Slc38a2、Slc38a4、Slc43a2、Slc7a5、Slc7a8 mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)，說(shuō)明宮內(nèi)暴露在高雄激素中能引起小鼠胎盤(pán)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平下調(diào)，影響轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是多方面的，可能與機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝異常有關(guān)，機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝異常可導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平異常，從而引起胎兒低出生體質(zhì)量。

綜上所述，宮內(nèi)暴露于高雄激素中能降低胎鼠體質(zhì)量及胎盤(pán)質(zhì)量，能降低胎盤(pán)氨基酸和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平，提示高雄激素暴露可能影響妊娠期胎兒宮內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)獲取，從而影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。