人乳腺癌端粒酶基因RNA與雌激素受體、細胞周期蛋白B1、C-erbB-2相關性研究

唐加步，姚運紅△，歐陽清，黃 冰

(1.廣東醫科大學東莞校區病理學系，廣東 東莞 523808；2.東莞市東城醫院病理科，廣東 東莞 523000;3.廣東醫科大學湛江附屬醫院病理科，廣東 湛江 524000)

端粒酶作為一種RNA依賴特殊DNA聚合酶，是一種特異合成端粒DNA的逆轉錄酶，是一種蛋白質與RNA組成的核糖核蛋白體。有研究表明，端粒酶的活化與惡性腫瘤的發生密切相關，其活性的維持對惡性腫瘤的發展和患者預后也十分重要[1]。G2/M期轉換的關鍵調控分子為細胞周期蛋白B1(CyclinB1)/P34CDC2復合物，CyclinB1在S期開始合成，G2期定位于細胞質中，與P34CDC2結合形成有絲分裂促進因子，促進細胞從G2期進入M期，從而完成有絲分裂。癌基因——C-erbB-2基因位于第17號染色體q21帶上，參與正常細胞的生長、分化和分裂，受到體內外某些因素作用后可被激活，具有腫瘤轉化活性。C-erbB-2在乳腺癌中的表達與組織學分級、淋巴結轉移等有關。本研究探討了人乳腺癌端粒酶基因RNA(hTR)、CyclinB1、雌激素受體(ER)、C-erbB-2基因的表達、臨床意義及相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2012—2013年在廣東醫科大學湛江附屬醫院接受乳腺癌根治術的乳腺癌患者70例，患者年齡16～67歲；其中浸潤性導管癌65例，浸潤性小葉癌5例；淋巴結轉移28例(40.0%)。70例患者術前均未給予任何抗癌治療，病理資料完整。

1.1.2試劑 (1)原位雜交試劑：地高辛標記的hTR-cRNA探針、蛋白酶K、馬血清、緩沖液和四唑氮藍/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸顯色液均由北京大學醫學部病理系提供。(2)免疫組織化學試劑：ER、CyclinB1、C-erbB-2基因單克隆抗體，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)試劑盒和DAB顯色試劑盒均為即用型，均由北京中杉金橋生物技術有限公司生產。ER、CyclinB1、C-erbB-2基因單克隆抗體SP試劑盒產品批號分別為E749809E、K126614B、C123406B；粘片劑氨醛酸乙基硅由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1標本處理 70例乳腺癌患者標本經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋。以4 μm連續切片，每個蠟塊均有蘇木精-伊紅染色對照片。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗及用不加一抗的切片作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。

1.2.2病理檢查 70例乳腺癌患者標本均經常規蘇木精-伊紅染色后由3位病理醫師確診。腫瘤病理分型、淋巴結轉移、腫瘤大小及相關臨床參數均參照國際標準。hTR檢測采用原位雜交方法，ER、CyclinB1、C-erbB-2檢測采取免疫組織化學SP法。

1.2.3結果判斷 由2名經驗豐富的病理醫師采用雙盲法至少觀察5個具有代表性高倍視野，不少于1 000個細胞，染色細胞數超過10%者判斷為ER、C-erbB-2、CyclinB1表達陽性，否則為表達陰性。hTR陽性表達為細胞核和細胞質著色，陽性信號為藍紫色顆粒；陰性為細胞不顯色。以不加探針及RNA酶處理切片作為陰性對照。乳腺癌組織ER陽性物質定位于細胞核，陽性反應為細胞核內出現棕黃色顆粒。CyclinB1陽性物質定位于細胞核，C-erbB-2基因定位于細胞膜，陽性反應為細胞膜上出現棕黃色顆粒。見圖1～4。

陽性物質定位于細胞核和細胞質，呈藍紫色顆粒。

陽性物質定位于細胞核，呈棕黃色顆粒。

陽性物質定位于細胞核，呈棕黃色顆粒。

1.3統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗。采用Spearman相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

陽性物質定位于細胞膜，呈棕黃色顆粒。

2 結 果

2.1hTR、ER、C-erbB-2、CyclinB1表達與臨床病理指標的關系 腫瘤大小、是否淋巴結轉移、不同組織分級患者hTR表達陽性率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；不同病理類型患者hTR表達陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。是否淋巴結轉移患者ER、C-erbB-2、CyclinB1表達陽性率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。不同組織分級、腫瘤大小患者CyclinB1表達陽性率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。不同病理類型、腫瘤大小、組織分級患者ER、C-erbB-2表達陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。ER與淋巴結轉移呈負相關(r=-0.329，P<0.05)，C-erbB-2、CyclinB1均與淋巴結轉移呈正相關(r=0.467、0.548，P<0.05)，CyclinB1與組織分級和腫瘤大小呈正相關(r=0.589、0.568，P<0.05)。

表1 hTR、ER、C-erbB-2、CyclinB1表達與臨床病理指標的關系[n(%)]

2.2hTR與ER、C-erbB-2、CyclinB1表達的相關性 腺癌組織hTR表達水平與ER無關(r=0.167，P>0.05)，與C-erbB-2、CyclinB1呈正相關(r=0.439、0.354，P<0.05)。

2.3ER與C-erbB-2、CyclinB1表達的關系 乳腺癌組織ER表達水平與C-erbB-2、CyclinB1表達均呈負相關(r=-0.402、-0.376，P<0.05)。

3 討 論

HIYAMA等[2]和YASHIMA等[3]認為，端粒酶表達與乳腺癌大小、淋巴結轉移、臨床分期及腫瘤進程有關，可作為判定乳腺癌患者預后的指標。本研究結果顯示，hTR表達陽性率與腫瘤大小、淋巴結轉移和組織分級有關，支持hTR可作為判定乳腺癌患者預后的指標。

乳腺癌是一種雌激素依賴性腫瘤。近年來，對ER在乳腺癌中的作用的研究較多。本研究結果顯示，ER表達陽性率隨組織分級增加，隨淋巴結轉移而降低，ER表達水平與淋巴結轉移呈負相關(P<0.05)。提示ER表達陰性的腫瘤惡性程度高，淋巴結轉移可能性大，患者預后不良。所以，對ER陰性患者即使是未見淋巴結轉移也應重視術后的綜合治療。本研究結果顯示，乳腺癌組織hTR表達水平與ER無關，提示乳腺癌的端粒酶激活可能與乳腺癌的雌激素因素無關。

C-erbB-2基因是表皮生長因子受體家族成員之一，位于染色體17q21，又稱為neu基因。C-erbB-2基因的異常表達明顯增加了乳腺癌轉移的風險，并降低了乳腺癌患者生存率[4]。C-erbB-2基因被認為是腫瘤患者預后不良相關的一個標記物，其過度表達與腫瘤細胞侵襲性、抗激素治療及總體低生存率明顯相關[5]。本研究結果顯示，C-erbB-2與淋巴結轉移呈正相關，支持其可作為判斷乳腺癌患者預后的重要指標。C-erbB-2與ER表達呈負相關，乳腺癌患者ER陽性者內分泌治療有效且預后較好，C-erbB-2的過度表達說明癌基因激活，使乳腺癌依賴激素生長的特性受到抑制，不能對內分泌治療產生反應[6]。乳腺癌組織hTR表達與C-erbB-2呈正相關，提示乳腺癌端粒酶激活可能與C-erbB-2基因有關。

人類多種腫瘤(如食管癌、非小細胞性肺癌等)均發現有CyclinB1的表達。有研究表明，乳腺癌的發病與多種細胞周期調控因子的異常表達相關[7-8]。乳腺癌有絲分裂指數和增殖指數與CyclinB1表達有關[9-10]，表明CyclinB1可干預G2/M期調控，促進細胞的異常分裂、增殖。DING等[11]研究發現，CyclinB1可作為判斷ER+乳腺癌患者預后的標志物，其發現CyclinB1對ER+乳腺癌患者無遠處轉移生存率、無病生存率、無復發生存率和總生存率均具有顯著的預測能力。本研究也發現，CyclinB1表達水平與hTR呈正相關，與ER呈負相關。表明在乳腺癌發生的過程中可能存在端粒酶激活與細胞周期關鍵調控因子CyclinB1異常表達的協同機制，但尚需進一步研究證實。