咖啡酸酰胺類衍生物的設計、合成及體外抗腫瘤活性研究

王 杰 張 暉 付映林 孫貝爾 劉 瑩 史冬雅 高子舜 楊亮亮

（蚌埠醫(yī)學院公共基礎學院 安徽蚌埠 233030)

腫瘤已成為造成人類死亡的第二大殺手[1]。據報道，我國癌癥的發(fā)病率高達201.1∕10萬，其中肺癌、乳腺癌、腸癌為我國第一、二、三名高發(fā)癌，嚴重威脅著人民生命安全和身體健康[2，3]。目前臨床針對癌癥的治療手段主要包括外科治療、化療、放療及分子靶向治療，以中藥小分子為模型化合物開發(fā)抗腫瘤化療、靶向治療藥物成為了科研工作者研究的熱點。

咖啡酸(圖1)，又稱3，4-二羥基肉桂酸，廣泛存在于金銀花、纈草、麝香草等植物種，工業(yè)多通過Knoevenagel-Doebner縮合反應進行合成。在臨床中咖啡酸片主要被用于預防外科、婦產科等手術出血和血小板減少癥。近代藥理學研究表明，咖啡酸也具有抗腫瘤、抗氧化和腦保護等生理活性[4]，但其對胃腸道具有刺激和生物利用度低等缺點，限制了其臨床運用。近年來，以咖啡酸為先導化合物，開發(fā)高效低毒的具有抗腫瘤作用的咖啡酸衍生物備受關注。王月華[5]等研究顯示，咖啡酸苯乙酯(圖1)對A549、Hela、MCF-7腫瘤細胞增值和遷移具有較好的抑制作用。唐雙意[6]等報道，迷迭香酸(圖1)可以抑制乳腺癌細胞MCF-7的增值，拮抗腸癌細胞Ls174-T轉移。另有研究顯示[7]，丹酚酸A(圖1)等咖啡酸衍生物也具有抗腫瘤活性。

四氫異喹啉類生物堿作為一種天然產物在毛茛科、小檗科等植物中分布廣泛，具有廣泛的生物活性，如抗血小板聚集、抗腫瘤、抗病毒等。Leese[8]等設計、合成了系列四氫異喹啉衍生物，其中化合物6、7、8(圖1)對burkitt淋巴瘤細胞增值具有較好的抑制作用。雷春花[9]等設計合成的異喹啉類生物堿TW9183(圖1)對A549、Hela的增值、遷移具有較好的抑制作用。

圖1 咖啡酸、咖啡酸苯乙酯、迷迭香酸、丹酚酸A、化合物（6、7、8）、TW9183結構

為了降低咖啡酸對胃腸道的刺激、提高生物利用度，開發(fā)新型高效低毒抗腫瘤藥物，本文作者利用生物電子等排原理和拼合原理，設計了3個咖啡酸酰胺類衍生物，合成路線見Scheme。采用SRB法對3個咖啡酸酰胺類衍生物體外抑制A549、MCF-7、HT-29腫瘤細胞增值活性進行了初步篩選。

Scheme 咖啡酸酰胺類衍生物的合成路線

一、實驗部分

（一）儀器與試劑。DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義星辰儀器設備有限公司）；DZF-6020-T型智能真空干燥箱（上海丙林電子科技有限公司）；HZK-FA110S電子天平（上海貴虎實業(yè)發(fā)展有限公司）；RE100B-Pro旋轉蒸發(fā)儀（上海弘懿儀器設備有限公司）；Waters Quattro Premier XE液質連用儀（杭州攜測信息技術有限公司）；Bruker600MHz超導核磁共振儀（CDCl3為溶劑，TMS為內標）。

對硝基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸、3，4-二甲氧苯甲酸、3，4-二甲氧苯乙胺、咖啡酸購自上海麥克林生化科技有限公司；甲苯、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸酐、SOCl2、石油醚等試劑均為市售分析純，購自合肥寶添科貿有限公司；薄層和柱層析用硅膠購自青島碩遠硅膠科技有限公司。

（二）合成方法。

1.乙酰咖啡酸的合成。將醋酸酐(12mL，111.1mmol)加入到一潔凈100mL燒杯中，滴加濃硫酸3滴，常溫下封口攪拌15min，然后一次性加入咖啡酸(10g，55.6mmol)，繼續(xù)攪拌至大量白色固體出現(xiàn)，換用玻璃棒繼續(xù)攪拌30min，F(xiàn)eCl3丙酮溶液檢測顯示反應完全。加入20mL水，充分攪拌，抽濾，將濾餅轉移至100mL燒杯中，滴加飽和Na2CO3至無氣泡生成，抽濾，濾餅用10mL水洗滌，合并濾液，往濾液中滴加3mol∕L鹽酸至pH=2-3，析出大量白色固體，抽濾，濾餅用水(60mL×3)洗滌，用30%乙醇重結晶，干燥，得白色固體7.1g，收率51.8%。

2.中間體6a的合成[10]。將對硝基苯甲酸(1.3g，7.6mmol)、甲苯25mL、SOCl210mL依次加入到帶有尾氣吸收回流裝置的150mL圓底燒瓶中，升溫至80°C反應5h，TLC[V(甲醇)：V(二氯甲烷)=1：10]檢測反應基本完全，減壓濃縮，并用甲苯(20mL×2)帶蒸，得粗品對硝基苯甲酰氯(2a)，用20mL無水CH2Cl2溶解，備用。

將 3，4-二甲氧苯乙胺(1.3g，7.2mmol)、25mL CH2Cl2依次加入到150mL三頸燒瓶中，常溫攪拌10min，待3，4-二甲氧苯乙胺充分溶解后，加入NaOH(0.7g，17.5mmol)，冰浴條件下，緩慢滴加二氯甲烷溶解的對硝基苯甲酰氯，約10min滴畢，繼續(xù)反應 2.0h。TLC[V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=1：1]檢測反應基本完全，將反應液轉移至分液漏斗，分別用3mol∕L HCl(100mL×2)、飽和Na2CO3(150mL×3)、飽和NaCl(150mL×3)洗滌，無水Na2SO4干燥2h，抽濾，減壓濃縮，用無水乙醇重結晶，干燥，得白色固體3a1.8g，收率75.8%。

將3a(1.8g，5.5mmol)、40 mL甲苯依次加入150mL帶有回流裝置的三頸燒瓶中，攪拌，升溫至80°C，待3a全部溶解后，緩慢滴加 POCl3(6.0mL，20mmol)，約 5min滴畢，升溫至115°C，反應7小時。TLC[V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=1：1]檢測反應基本完全，轉移至150mL圓底燒瓶，減壓濃縮，冷卻至室溫，加30mL乙酸乙酯、50mL水充分攪拌，取水層，冰浴條件下，用濃氨水調至pH=9-10，加入50mLCH2Cl2，充分攪拌，轉移至分液漏斗靜置，取CH2Cl2層，用飽和NaCl(50mL×2)洗滌，無水Na2SO4干燥2 h，抽濾，減壓濃縮，得淡黃色油狀物4a1.4g，收率82.4%，直接用于下步反應。

將化合物4a(1.4g，4.5mmol)、20mL甲醇依次加入150mL圓底燒瓶中，冰浴下攪拌至4a完全溶解，然后將NaBH4(0.5g，13.5mmol)分5批加入，繼續(xù)攪拌4h。TLC[V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=1：1]檢測反應基本完全，減壓濃縮，加入30 mL CH2Cl2，震蕩，轉移至分液漏斗，用水(50mL×2)洗滌，無水Na2SO4干燥2 h，抽濾，減壓濃縮，過硅膠柱，濃縮，用20 mL甲醇溶解，冰浴下滴加濃鹽酸，抽濾，濾餅干燥，得白色固體5a1.2g，收率75.9%。

3.目標產物6a的合成。按2a的制備方法，制備乙酰咖啡酰氯二氯甲烷溶液，乙酰咖啡酸的投料量為0.6g(2.3mmol)，二氯甲烷用量為15mL。

將5a(0.8g，2.3mmol)、CH2Cl220mL依次加入150mL三頸燒瓶中，冰浴攪拌下加入Et3N(0.8mL，0.6g，5.7mmol)，待溶液澄清后，將制備的乙酰咖啡酰氯二氯甲烷溶液緩慢滴入，約8min滴畢，繼續(xù)反應2.5h。TLC[V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=1：1]檢測反應基本完全，將反應液轉移至分液漏斗，分別用3mol∕L HCl(60mL×2)、飽和Na2CO3(90mL×3)、飽和NaCl(90mL×3)洗滌，無水Na2SO4干燥2h，抽濾，減壓濃縮，過硅膠柱，減壓濃縮，干燥，得白色固體6a 0.8 g，收率61.5%。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：8.16(d，J=8.4Hz，2H，ArH)，7.74(d，J=15.6Hz，1H，CH=CH-Ar)，7.50(d，J=9.0Hz，2H，ArH)，7.43(dd，J=8.4Hz，J=1.8 Hz，1H，ArH)，7.39(s，1H，ArH)，7.24(d，J=8.4Hz，1H，ArH)，7.02(s，1H，ArH)，6.88(d，J=15.6Hz，1H，CH=CH-Ar)，6.72(s，1H，ArH)，6.55(s，1H，CHN)，4.04-4.01(m，1H，NCH2CH2)，3.92(s，3H，OCH3)，3.80(s，3H，OCH3)，3.49-3.45(m，1H，NCH2CH2)，3.05-3.00(m，1H，NCH2CH2)，2.84-2.81(m，1H，NCH2CH2)，2.33(s，3H，CH3)，2.32(s，3H，CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ：168.20，168.09，165.27，149.56，148.62，148.03，147.27，143.16，142.42，142.12，133.99，129.60，126.48，126.41，125.56，123.91，123.58，122.29，117.93，111.28，110.96，60.42，56.03，55.98，54.91，40.28，28.79，20.68;ESI-Mass：m∕z560.9(M++H)。

通過6a的合成方法制備咖啡酸酰胺類衍生物6b、6c。

6b：白色固體，收率 60.6%，1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.70(d，J=15.0 Hz，1H，CH=CH-Ar)，7.43-7.37(m，2H，ArH)，7.23-7.17(m，3H，ArH)，6.97(s，1H，ArH)，6.88-6.81(m，3H，ArH，CH=CH-Ar)，6.68(s，1H，ArH)，6.57(s，1H，CHN)，3.99-3.96(m，1H，NCH2CH2)，3.91(s，3H，OCH3)，3.80(s，6H，OCH3×2)，3.51-3.46(m，1H，NCH2CH2)，3.00-2.97(m，1H，NCH2CH2)，2.81-2.72(m，1H，NCH2CH2)，2.32(s，3H，CH3)，2.31(s，3H，CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ：168.12，164.78，158.93，148.07，147.70，142.93，142.36，141.25，134.67，134.33，130.09，128.81，127.20，126.29，126.24，123.82，122.18，118.70，113.92，113.59，111.23，60.42，55.96，55.92，55.27，39.55，29.05，20.67;ESI-Mass：m∕z 546.0(M++H)。

6c：白色固體，收率 66.5%，1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.70(d，J=15.6 Hz，1H，CH=CH-Ar)，7.42(d，J=9.0 Hz，1H，ArH)，7.37(s，1H，ArH)，7.23(d，J=8.4 Hz，1H，ArH)，7.01(s，1H，ArH)，6.96(s，1H，ArH)，6.89(d，J=15.6 Hz，1H，CH=CH-Ar)，6.76(d，J=8.4 Hz，1H，ArH)，6.72(s，1H，ArH)，6.68(s，1H，ArH)，6.58(s，1H，CHN)，3.99-3.96(m，1H，NCH2CH2)，3.91(s，3H，OCH3)，3.86(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.79(s，3H，OCH3)，3.52-3.47(m，1H，NCH2CH2)，3.00-2.97(m，1H，NCH2CH2)，2.82-2.71(m，1H，NCH2CH2)，2.33(s，3H，CH3)，2.32(s，3H，CH3);13C-NMR(150 MHz，CDCl3)δ：168.11，165.42，164.85，148.89，148.43，148.09，147.64，142.94，142.37，141.26，135.12，134.30，126.99，126.29，123.84，122.18，121.23，120.10，118.69，112.19，111.29，110.99，110.38，60.42，55.96，55.91，55.87，54.99，39.59，29.07， 20.67;ESI-Mass：m∕z575.9(M++H)。

（三）藥理測試[11]。采用細胞株為：肺癌A549細胞、人乳腺癌MCF-7細胞、人結腸癌HT-29細胞；配制目標化合物和秋水仙堿，使其濃度分別為0μM、0.1μM、1μM、10μM、100 μM、200μM，將對數(shù)生長期的A549、MCF-7、HT-29細胞以1×105cells∕孔接種于96孔板，每孔含RPMI1640完全培養(yǎng)基（10%FBS）200μL，置于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)過夜，棄上清液，分別加入配制濃度的6a、6b、6c、秋水仙堿，繼續(xù)培養(yǎng)72h；在每孔加入50%的TCA固定1小時；用去離子水對每孔進行洗滌，甩干，空氣干燥后，加入100μlSRB液，室溫染色10分鐘，用1%醋酸洗滌（未結合的SRB）或非緩沖Tris堿液洗滌（結合的SRB），空氣干燥。細胞振蕩儀上振蕩10min，待結晶物充分溶解后用酶標儀測定OD540。抑制率=（無藥細胞對照孔OD值-用藥孔OD值）∕無藥細胞對照孔OD值×100%

二、結果

通過檢索文獻和結合多年工作經驗，作者利用藥物化學中的生物電子等排原理和拼合原理，設計了3個咖啡酸酰胺類衍生物。以取代苯甲酸和3，4-二甲氧苯乙胺為起始原料，通過酰胺化反應、Bischler-Napieralsk反應、硼氫化鈉還原反應合成中間體5a-5c，5a-5c與乙酰化咖啡酰氯通過酰胺化反應，合成3個白色固體目標產物6a-6c，其結構均經MS、1H NMR和13C NMR確證。

3個目標產物6a-6c對A549、MCF-7、HT-29癌細胞的抑制活性通過SRB法進行了檢測，結果見表1。

表1 目標化合物對A549、MCF-7、HT-29癌細胞的抑制活性

三、討論

取代苯甲酸與SOCl2反應制備2a-2c時，回流過程中要觀察反應液是否澄清，如果不澄清，需滴加2-3滴DMF，否則產率較低；3a-3c通過Bischler-Napieralsk反應制備4a-4c過程中，滴加POCl3時的溫度對此步產率具有較大影響，通過實驗摸索發(fā)現(xiàn)，滴加POCl3時的溫度控制在80-85℃間最佳，溫度過低或過高滴加POCl3時，反應過程中均會產生黑色粘稠物，導致4a-4c收率較低；通過實驗摸索，發(fā)現(xiàn)硼氫化鈉的加入量是4a-4c的3倍當量時，收率最高，另外硼氫化鈉要在冰浴下緩慢加入，防止液體濺出。

藥理活性通過SRB法進行研究，結果顯示，6a、6b、6c對A549、MCF-7、HT-29癌細胞均有一定抑制活性，其中6b、6c對A549癌細胞的抑制活性與秋水仙堿相當，6c對MCF-7癌細胞的抑制活性顯著優(yōu)于秋水仙堿，可能在苯環(huán)B中引入給電子基團會增加咖啡酸酰胺類衍生物對A549、MCF-7癌細胞的抑制活性，其具體構效關系有待于進一步研究。

四、結語

本文依據生物電子等排原理和拼合原理，設計、合成了3個咖啡酸酰胺類衍生物，藥理實驗表明，設計、合成的咖啡酸酰胺類衍生物體外對A549、MCF-7、HT-29癌細胞均具有抑制活性。