灌木型柳樹雜種無性系鉛的積累特性及其遺傳變異

黃瑞芳，王紅慧，王紅玲，施士爭*

(1.江蘇省林業科學研究院，江蘇 南京 211153； 2.江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014； 3.江蘇省農產品質量檢驗測試中心，江蘇 南京 210036)

鉛不能被生物代謝所分解，且能通過食物鏈在動物和人體內富集，對腎臟、血液、神經系統等危害極大[1-2]。柳樹積累性高，植物修復能力強，適合用于修復重金屬污染[3-5]。灌木類柳樹適應性強,速生,生物量大,扦插造林成本極低。根系發達，比表面積大，且主要分布在深0—40 cm的土層，位于重金屬主要分布層[6-8]。灌木柳條還可用作工業原料、編織工藝、生物能源和園林觀賞等，具有較高的經濟價值，又不直接與食物鏈相聯系，與草本相比，優勢明顯[9-10]。

植物對重金屬積累特性的遺傳變異規律是研究植物修復的基礎和關鍵，目前在重金屬對植物的毒性效應上研究較集中，對植物的重金屬積累特性遺傳變異研究較少。本文以作者前期篩選的鉛耐受性強的無性系作為父母本[11]，共8個雜交組合的51個灌木柳樹無性系為試驗材料，以前期確定的適宜鉛污染濃度[12]，通過水培方法測定了其在鉛污染狀況下(300 μM)的成活率、受害指數，分根、莖、葉測定了鉛含量和鉛總量，旨在分析灌木柳樹雜交組合間的鉛積累特性及其遺傳變異差異，掌握灌木柳樹重金屬積累特性的遺傳變異特征，以便為柳樹的重金屬耐性遺傳改良提供理論依據，篩選具有更高重金屬富集能力的無性系或基因型，提高修復效率，加快修復進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為筆者于2013年根據重金屬耐受性進行定向雜交所獲得的子代，包括杞柳×簸箕柳的雜交組合，簸箕柳×簸箕柳的2個雜交組合，以及毛枝柳×簸箕柳、毛枝柳×黃花柳和二色柳×簸箕柳的各1個雜交組合。經過苗期初篩，選取的8個雜交組合共51個灌木柳樹無性系(見表1)。所有的灌木柳樹均來自于江蘇省林業科學研究院國家柳樹良種基地柳樹種質資源圃。

表1 供試無性系

1.2 試驗方法

試驗采取水培法。所有灌木柳樹于2020年3月從江蘇省林業科學研究院柳樹種質資源圃采穗，均選取長15 cm、直徑為1 cm的健壯插穗，清水培養14 d后，挑選生長勢一致的柳樹苗，置于定植籃中，每籃10株。用改良Hoagland′s培養液培養28 d后進行鉛處理14 d，之后收獲植株。Pb2+以Pb(NO3)2的形式加入，濃度為300 μM。試驗設置重復3個，每重復10株。試驗過程中每7 d換培養液1次。為避免鉛產生沉淀，開始鉛脅迫后，培養液中不再加入KH2PO4。

1.3 測定方法

本試驗以灌木柳樹無性系受鉛脅迫后的受害指數[13]、生物量以及體內鉛含量為分析指標。脅迫實驗結束后分根、莖、葉收獲植株，先用自來水沖洗，然后用去離子水反復沖洗干凈并用吸水紙擦干，根部用EDTA洗去表面附著的鉛，105 ℃殺青30 min后，烘干至恒重，分別稱其生物量(即干物質量，dry weight，DW)。按照《食品安全國家標準 食品中鉛的測定》(GB5009.12-2017)中的方法進行植物根、莖、葉鉛含量的測定。受害指數根據參試無性系的受害等級進行計算，共分為7個受害等級(見表2)，受害指數(P)按照以下公式計算：

表2 柳樹受害癥狀的分級標準

其中，ni為達到第i等級的株數；ki為第i等級的分值，i=0，1，…6。

得到的數據利用Excel 2010和IBM SPSS Statistics 19分析。

2 結果與分析

2.1 鉛脅迫下不同雜交組合的成活率比較

成活率反映了灌木柳樹在受到鉛脅迫時的生長狀況，對鉛脅迫下各灌木柳樹的成活率進行統計，對不同雜交組合進行差異比較(見表3)，結果顯示：不同雜交組合間的成活率存在顯著差異，P1025×P63的成活率最低，只有(71.52±36.94)%， 而P646×P63，P1024×P63，P126×P63和P126×P585的成活率均達到100%。變異最大的為P1025×P63雜交組合，變異系數為51.65%。

表3 灌木柳樹雜交組合的成活率

2.2 鉛脅迫下不同雜交組合的受害指數比較

本文用受害指數反映鉛脅迫下灌木柳樹的受害等級和灌木柳樹對鉛的耐性能力。鉛脅迫下各無性系的受害指數分布范圍為2.08%—97.22%，受害指數在10%以下的有6個無性系，在10%—50%之間的有26個無性系。受害指數較低的10個無性系見表4。

表4 受害指數較低的灌木柳樹排名

鉛脅迫下各雜交組合的受害指數見表5。由表5可知，P126×P585的受害指數顯著低于其他雜交組合，只有(3.70±2.27)%，P294×P63的受害指數最高，為(58.54±25.52)%。雜交組合內變異最大的為P1025×P63(變異系數達到63.11%)，變異最小的為P126×P63(變異系數為31.14%)。

2.3 鉛脅迫下不同雜交組合的生物量比較

鉛脅迫下各雜交組合的生物量見表5。生物量分布范圍為0.28—20.17 g，在鉛脅迫下，不同雜交組合間的生物量平均值存在一定差異， P126×P63的子代的生物量平均值顯著大于其他雜交組合，為(13.85±4.95) g ，生物量平均值最小的為P294×P63[(6.05±4.84) g]。變異最大的為P294×P63，變異系數達到79.97%，變異最小的為P126×P585，變異系數為8.76%。

表5 鉛脅迫下灌木柳樹的受害指數和生物量

不同雜交組合的存活率、受害指數和生物量的平均值均存在一定差異，但各雜交組合的子代無性系相應的變異系數也較大，這就說明每個雜交組合內的子代無性系間存在較大的差異。相同雜種組合杞柳×簸箕柳的3個不同的雜交組合的存活率、受害指數和生物量均存在顯著差異。

2.4 鉛脅迫下不同雜交組合的鉛含量比較

為了進行無性系水平上的鉛積累能力比較，本文以生物量和受害指數為指標，選擇生物量和受害指數都超過平均值的共計20個無性系進行根、莖、葉鉛含量測定的分析，這20個無性系隸屬的雜交組合見表6，測定結果見圖1。

表6 20個無性系隸屬的雜交組合

方差分析結果顯示各無性系的鉛含量存在顯著差異。從圖1可以看出，參試無性系的不同部位的鉛含量相差很大，葉部鉛含量在7.8—32.8 mg/kg，莖部鉛含量在10.5—42.3 mg/kg，而根部鉛含量在792.3—3 498.3 mg/kg，根部的鉛含量是莖、葉部鉛含量的近百倍。

圖1 鉛脅迫下灌木柳樹不同部位(根、莖、葉)的鉛含量

參試無性系的葉部鉛含量和莖部鉛含量的高低并沒有表現出一致性，其中莖部鉛含量大于葉部鉛含量的無性系有12個，而葉部鉛含量大于莖部鉛含量的無性系有8個。

2.5 鉛脅迫下灌木柳樹的鉛總量

為評估各無性系生物修復能力，現對各無性系的鉛總量進行測定，從而得出各無性系體內固定的鉛總量，結果見圖2。

方差分析結果顯示各無性系的鉛總量存在顯著差異。從圖2可以看出，整株鉛總量在776.53(無性系16)—3 549.61 μg(無性系23)。雖然根部的生物量較小，但是鉛含量極顯著高于莖和葉，根部鉛總量占整株鉛總量的64.47%(無性系43)—91.28%(無性系28)，莖部鉛總量占比為3.70%(無性系17)—16.08%(無性系51)，葉部鉛總量占比為4.45%(無性系28)—20.72%(無性系43)。

圖2 鉛脅迫下灌木柳樹不同部位(根、莖、葉)的鉛總量

2.6 鉛脅迫下不同雜交組合及無性系的鉛積累特性的比較

對無性系超過3個的雜交組合進行差異性顯著分析及多重比較(見表7)，符合條件的有P336×P63，P61×P63和P126×P63等3個雜交組合，各雜交組合的根鉛含量為1 548.75—1 962.95 mg/kg，鉛含量無顯著差異，變異最大的為P336×P63，變異系數為50.79%，變異最小的為P61×P63，變異系數為36.81%；鉛總量在1 644.51—2 431.42 μg，鉛總量也無顯著差異，變異最大的為P61×P63，變異系數為45.91%，變異最小的為P126×P63，變異系數為39.72%。

表7 雜交組合子代無性系(>3個)的鉛含量和鉛總量的變異

雖然雜交組合間的鉛積累特性無顯著差異，但對20個無性系的根、莖和葉的鉛含量以及鉛總量進行方差分析顯示：各無性系間存在較大的差異。

3 結論與討論

本研究中，鉛處理后柳樹的存活率、受害指數、生物量在供試8個雜交組合間均存在明顯差異，總體而言，P126×P585的存活率達到100%，受害指數低至3.70%，生物量為10.77 g，表現較好；而P1025×P63的存活率低至71.52%，受害指數高達53.47%，生物量也低至6.55 g，表現較差。

魏童等[14]的研究顯示，青楊的鎘富集能力在種群間和無性系間都存在明顯的變異性，表明可以通過開展種源/無性系選擇，選育出富集能力更高的基因型，從而提高植物修復的效率。Yang等[15]研究比較了12個柳樹無性系在50 μmol/L銅、鋅營養液中耐銅、鋅能力的變化，結果顯示柳樹對銅和鋅的耐性和積累量因無性系而異。本研究中鉛處理后柳樹根、莖和葉中的鉛含量和鉛總量在雜交組合間無顯著差異，但在無性系間存在顯著差異。由無性系的鉛含量變異性和分布可以看出，無性系間的變異很大，其中更能衡量富集能力的根中鉛含量最高的無性系為12號，達到3 498.3 mg/kg，根中鉛含量最低的無性系為16號，只有792.3 mg/kg。整株體內鉛總量較高的有無性系23，35，28，40,12號，較低的有無性系16，22，51，11,4號。由此可見柳樹的鉛富集能力在無性系間存在明顯的變異性，這也顯示在良種選擇上可以直接在無性系水平上選擇。

本研究中的無性系43號，受害指數較低，為5.56%，體內的鉛含量也較低，為828.67 mg/kg。這可能是因為該無性系在鉛脅迫下拒絕主動吸收對生長有害的鉛[16]，通過合成胼胝質或Fe-Mn氧化膜等物質來組織重金屬進入根系[17]，這些無性系被認為是較耐鉛的品種。而本試驗中的無性系12號和40號，其受害指數分別為2.08%和4.63%，但是其鉛含量卻高達3 498.33，2 943.67 mg/kg。這可能是由于該無性系主動吸收了鉛之后通過體內螯合、儲存在體內活性較弱的組織等手段使鉛對自身生長的危害降到最低[18]。這些無性系應是鉛高積累品種，是適合大量提取環境中的鉛污染進行生物修復的專用品種，這為進一步研究其耐鉛和鉛積累機理及進行生物修復提供了材料。

本研究中參試無性系的葉部鉛含量和莖部鉛含量的高低并沒有表現出一致性。這與房娟[19]的研究不同，該研究認為根>莖>葉，可能是因為其參試無性系較少，只有垂柳和蘇柳172良種喬木柳，本試驗的無性系較多，為20個灌木柳無性系。到底是因為喬木柳和灌木柳的不同，還是無性系個數造成試驗結果的差異，還有待進一步試驗。

施翔等[20]的研究顯示Pb向地上部的轉移相對較少，根部是鉛在柳樹體內存儲的主要庫。本研究顯示，灌木柳樹在受到鉛脅迫時，根部鉛總量占整株鉛總量的64.47%—91.28%，這就表明鉛主要積累在根部，而莖、葉中含量較少，這可能是由于Pb在根系主要以沉淀形式存在，如Pb3(PO4)2和PbCO3等，且重金屬大部分儲存在結構栓化和木質化的根表皮部[21]，因此很難向地上部進行長距離運輸[22]。在土壤鉛污染生物修復中，可以選擇鉛積累能力強的灌木柳樹無性系，通過蘸取生根劑等方法促進根系生長，在每年年底落葉前收割地上部分，從而減少枯枝落葉中的污染物回田，于第3年利用小型農機翻耕土地收獲灌木柳樹根部，從而修復重金屬污染土壤，相應縮短修復年限，這較其他木本植物具有較強的優勢。