體外模擬消化技術研究進展

李 諾 張東杰,2 張桂芳 鹿保鑫

(1. 黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2. 黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室，黑龍江 大慶 163319；3. 黑龍江八一農墾大學國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319)

人體消化道包括口腔、咽、食管、胃、小腸和大腸等部位，消化道與消化腺共同組成體內完整的消化系統(tǒng)。隨著消費者對食品健康與營養(yǎng)重視程度的不斷上升，有關人體攝入成分在體內的作用效果研究也逐漸深入。體外模擬消化技術是利用仿生原理，選用合適的藥品試劑高度模擬體內消化環(huán)境，最大程度地模擬食物在體內消化、吸收過程，是測定食物消化吸收過程中營養(yǎng)成分含量、消化吸收率、目標成分釋放率等變化的一種檢測手段。相比于體內消化試驗，體外消化能反映食物攝入后的消化利用情況，具有耗時短、成本低、可重復性強且不受道德倫理約束等優(yōu)點[1-2]。文章擬對體外模擬消化技術的應用現狀進行綜述，列舉常用的體外消化模型，并主要介紹口腔、胃、腸道消化模型，旨在為食物中某種功能性成分在消化前后含量、結構等變化的進一步檢測提供依據。

1 體外模擬消化概述

消化是動物或人的消化系統(tǒng)將食物變成可以被機體消化吸收的營養(yǎng)成分的過程，其原理是營養(yǎng)物質被機體攝入后，經消化管的運動和消化酶的作用，將大塊的、分子結構復雜的攝入成分分解成能被吸收的、分子結構簡單的成分，然后再將其吸入體內。例如食物中的蛋白質、脂肪、淀粉等生物大分子，在消化酶的作用下被分解成水溶性小分子物質的過程被稱為消化。體外模擬消化是指根據機體消化生理特點，在體外環(huán)境中建立消化模型，用于模擬孵化攝入物在體內消化、分解過程的一種技術手段，一般包括口腔消化、胃消化和腸消化過程，其原理是在體外環(huán)境下，選擇生物學pH、溫度條件和消化酶系，創(chuàng)建與體內相近的消化環(huán)境，模仿口腔、胃和腸道階段對食物在體內經過一系列酶的分解作用過程；考察攝入物在體內的消化吸收情況，對攝入物的消化中間產物或終端產物的消化吸收情況進行評價。

2 體外模擬消化模型分類

根據消化狀態(tài)的不同，體外模擬胃腸消化系統(tǒng)可分為靜態(tài)模擬消化和動態(tài)模擬消化兩大類；動態(tài)模擬能更準確地表達消化過程中功能成分量的變化，且周期性取樣檢測具有實時觀察量變的特點。靜態(tài)、動態(tài)模擬消化又包括單相靜態(tài)胃腸模擬系統(tǒng)、半連續(xù)穩(wěn)態(tài)胃腸模擬系統(tǒng)和連續(xù)動態(tài)胃腸模擬系統(tǒng)[3-5]，其中最常用的是單相靜態(tài)胃腸模擬系統(tǒng)。按照消化物成分的不同，又可將體外模擬消化分為蛋白質體外消化模型、糖類體外消化模型、酚類體外消化模型、維生素體外消化模型等。按照模擬消化部位的不同可分為口腔消化模型、胃消化模型和腸道消化模型。

2.1 靜態(tài)消化模型

靜態(tài)消化模型目前使用最為廣泛，通常是將燒杯或三角瓶放置于37 ℃的恒溫振蕩水浴槽中振蕩，振蕩頻率60～250 r/min，其主要適用范圍是簡單的食物樣品或者是經分離、純化后的待測樣品，在局部進行的營養(yǎng)物質體外模擬消化研究，具有操作簡單，省時方便的特點,但不能模擬消化物消化吸收的過程，無法模擬體內消化過程中發(fā)生的剪切、混合等物理變化，且消化產物不會被吸收。靜態(tài)消化模型通常被用于評估食品中蛋白質潛在的過敏源風險[6]，如獼猴桃過敏源和鯉魚過敏源的研究[7-8]，非過敏源蛋白質在15 s內被降解，致敏性蛋白質不易被胃蛋白酶消化，如花生、大豆和牛奶中的蛋白質[9]，這些蛋白質或者未被消化，或者需經過1 h被降解成小分子肽，因此根據其消化特性，常使用靜態(tài)消化模型進行過敏源試驗研究。

2.2 動態(tài)消化模型

體內腸道消化是一個動態(tài)的過程，包括胃的排空、蠕動以及消化過程中pH值、酶的分泌等變化，由于靜態(tài)消化模型不具備這些特點，因此與實際的消化情況相差較大。研究[10]發(fā)現，在增加了用于模擬胃腸蠕動的機械裝置后，動態(tài)消化模型能夠更加準確地模擬體內消化過程。其優(yōu)點是能夠模擬胃腸道消化過程中的物理變化過程，例如通過動態(tài)模型可以觀察消化物在消化過程中不同時間下的黏度、破碎粒度等物理形態(tài)，也可以觀察膠體的產生、擴散等，以檢測不同消化階段的營養(yǎng)成分變化[1]。而動態(tài)消化模型又分為單室動態(tài)消化模型、雙室和多室動態(tài)消化模型，其中多室動態(tài)消化模型是目前最全面、最為接近體內胃腸消化系統(tǒng)的模型，共分為5個區(qū)間，分別代表消化道胃、十二指腸、空腸、回腸和結腸的5個不同組成部分，此模型能夠模擬體內消化的大部分參數，如人體溫度、胃消化pH 值變化、胃液和胰液自動分泌、胃排空、胃和腸的消化時間、蠕動混合以及蛋白酶的連續(xù)增加量等[1,11]。此外，動態(tài)消化過程的模型還包括胃腸道模型(TNO)、IFR單室動態(tài)模型(DGM) 模型和人體胃模擬器(HGS)等[3,12]。

2.3 口腔消化模型

體外模擬消化試驗中，口腔消化模型即唾液消化模型。口腔消化是模擬食物在口腔內經咀嚼后被唾液淀粉酶分解的過程，其基本流程是將食物樣品提純后加入至pH值為6～7(常用磷酸鹽緩沖液調節(jié)溶液pH)的α-淀粉酶溶液中，于37 ℃下振蕩孵育。若固體樣品不經口腔消化過程，僅用簡單的剪切方式對食物進行粉碎處理，會導致食物樣品變?yōu)閮炔磕哿^強的食團，這種食團在胃腸環(huán)境中不易被分散以至于難以被消化。若是液體樣品或是單一成分樣品，因其顆粒較小，無需咀嚼過程，只需添加唾液淀粉酶進行水解[1]；若食物樣品中所含碳水化合物成分幾乎不影響試驗結果，可不經過口腔模擬消化，直接進行胃腸環(huán)境模擬消化。

許芳溢等[13]在苦蕎芽粉饅頭體外消化試驗中采用口腔(即唾液)模擬消化，用NaCl和α-淀粉酶配制成唾液模擬液，用磷酸鹽緩沖液調節(jié)溶液pH至6.75后，加入適量的樣品均質混勻后，37 ℃下水浴振蕩10 min，得到口腔消化后溶液。李占明等[2]模擬了pH值為7的口腔消化液，選用在竹葉黃酮提取物溶液中加入適量的α-淀粉酶，經旋渦混勻后37 ℃下孵育10 min，將口腔消化液pH值調至2，滅酶后進行了相關指標的測定。熊文等[14]在pH 7的條件下向藜蒿葉多酚純化物中加入α-淀粉酶，經37 ℃水浴振蕩后，進行下一階段消化。以上3種方法都可用于含有多酚類物質的體外消化試驗，且消化情況較好。

口腔消化階段是胃腸消化的基礎，盡管與胃腸消化階段相比，口腔消化因吸收時間短、吸收濃度低等消化特性，導致口腔消化過程中生物利用率最低，但作為完整的體外模擬消化系統(tǒng)，口腔消化是不可缺少的過程。而多個口腔消化模型存在細微差別，原因可能是口腔消化環(huán)境是動態(tài)過程，且體內消化水平也會因人而異，試驗時應盡可能地仿照消化常態(tài)進行。

2.4 胃消化模型

胃腸消化模型能夠有效解決胃腸道消化研究中存在的倫理問題，高相似度的模擬生物體內胃腸消化情況。隨著研究領域的深入，近年來胃環(huán)境消化模擬在機體胃腸道對食物或藥物的消化性研究中應用廣泛，通常使用HCl調節(jié)模擬胃液pH值至2.0左右，選用胃蛋白酶進行消化，可將其溶于NaCl溶液，也可以選擇KCl、CaCl2溶液進行溶解[15-16]，再于37 ℃下水浴振蕩，得到胃消化液。

許芳溢等[13]選用苦蕎芽粉饅頭進行體外模擬胃消化，將適量的胃蛋白酶溶于NaCl中，用HCl調節(jié)溶液pH值至1.2得到模擬胃液。將口腔消化后的溶液用HCl調節(jié)溶液pH值為1.5，而后加入適量的模擬胃液，經水浴振蕩進行消化，待反應結束后取適量樣液，于70 ℃水浴鍋中滅酶，取樣待進一步檢測。而李占明等[2]在檢測竹葉黃酮提取物經胃環(huán)境體外消化模擬試驗中，將胃蛋白酶加入至pH值為2.0的口腔消化后的樣品溶液中，37 ℃孵育90 min，將溶液pH值調至7.0±0.1進行取樣，即為胃消化后的樣品待測液。陸俊等[17]對黑色食品進行體外消化試驗，采用連續(xù)的、周期的取樣測定以更加準確地模擬體內消化過程：將處理后的樣品懸濁液用HCl溶液將pH值調至2.0，再加入適量的胃蛋白酶和HCl混合溶液，此時得到胃模擬消化液，分別于反應0，1，2 h時取樣檢測；同時用去離子水作空白對照，用0.01 mol/L鹽酸溶液作對照組，試驗組與對照組均避光并充入氮氣，37 ℃水浴搖床消化2 h，取上清液進行測定。靳志強等[18]在小米粉體外模擬消化試驗中進行了模擬胃消化階段，在模擬胃液中加入HCl使溶液pH保持在2.5以下，加入胃蛋白酶和樣品混合液，繼續(xù)孵育2 h，得到胃模擬消化液。綜上，用HCl將消化環(huán)境pH調至2左右，胃蛋白酶添加量根據不同原料而不同；體外模擬消化盡可能達到與體內消化一致，就胃消化模型結果而言，在多個體外模擬消化試驗中，胃消化液中目標成分含量出現峰值，且胃消化液的生物利用率最高，但是在胃消化過程中酶促反應變化以及多種酶共同作用對消化產生的影響無法模擬，是目前難以解決的問題。

2.5 腸消化模型

一般而言，腸環(huán)境消化是先經過胃環(huán)境消化后再進行的，常用NaHCO3中和溶液pH至6.5左右后，將胰酶和膽汁加入到胃消化后的樣品溶液中，37 ℃水浴振蕩，此時得到腸環(huán)境模擬液。

許芳溢等[13]在模擬腸環(huán)境消化過程中，用NaHCO3溶液將胃消化液pH調為6，加入膽汁—胰酶復合物模擬腸液，再分別加入適量的NaCl溶液和KCl溶液，37 ℃水浴震蕩2 h進行模擬腸道消化過程，再于70 ℃水浴滅酶。李占明等[2]在腸消化過程中使用膽汁鹽和胰酶混合液得到腸道模擬液，具體操作為將膽汁鹽—胰酶混合液置于37 ℃下孵育90 min后，于95 ℃水浴滅酶10 min，此時得到模擬腸道消化后的樣品。陸俊等[17]將胃模擬消化液pH值調至7.0，加入膽汁鹽、胰酶配置成模擬腸液，得到腸模擬消化液，并且用NaHCO3溶液作空白對照組，試驗組與對照組均避光充入氮氣，于37 ℃恒溫水浴搖床中消化2 h，取上清液進行測定；與對照組相比，胰酶和膽汁可以促進多酚類物質的釋放，提高其釋放量的增長率。

腸道消化過程中，也可使用透析原理模擬小腸吸收過程，其大體流程：將透析袋用NaCl和NaHCO3無泡沫填充并系緊，待胃消化結束后迅速將透析袋完全浸入胃消化液中，混合溶液于37 ℃水浴振蕩45 min，調節(jié)pH至6.5左右[19-20]，此時進行腸道消化、吸收過程。使用透析袋的優(yōu)勢是：在封閉體系內進行體外消化，隨著消化時間的延長，消化產物會不斷積累，因而會對酶解產生抑制作用，而選用透析袋，利用透析袋的透析作用模擬小腸的吸收，避免了產物的抑制作用，可用來考察目標成分的生物利用率，能夠更為準確地獲取目標成分從進入口腔最終到腸道消化、吸收后其最終含量，更為完整地模擬體內消化吸收過程，增加試驗的可信度與準確性。

對于口腔、胃腸消化過程而言，設計從口腔經過胃而后到達腸道的一個連續(xù)消化的、較為完整的消化系統(tǒng)，其干擾性更小，更有說服力，更貼近生物體的消化系統(tǒng)。胃腸消化過程中，周期性地取樣檢測能夠更加直觀地檢測出目標成分在胃腸環(huán)境消化過程中含量的變化，以動態(tài)的形式更貼切地反映消化過程。不同樣品目標成分的存在形式不同，導致胃、腸消化階段中目標成分釋放量不同，胃消化和腸消化通常先后進行，對于不同的消化過程，胃腸道消化液的生物利用率最高。

3 體外模擬消化的應用領域

目前體外消化系統(tǒng)已被廣泛應用于考察食品消化過程中的物理化學變化以及功能活性物質的代謝研究，考察其生物利用率、腸道運輸和代謝、脂質體等功能活性物質釋放與代謝、益生菌和益生元代謝分析、藥物緩釋釋放研究、重金屬污染物、真菌毒素等有毒物質的代謝研究、動物營養(yǎng)及代謝特性分析等多個領域。文章主要對食品中幾種常見的功能性成分的體外模擬消化檢測其生物利用情況進行概述。

3.1 體外模擬消化技術在淀粉中的應用

淀粉作為第二大可再生碳水化合物資源，在自然界分布廣泛。目前有研究將體外模擬消化技術應用于餐后血糖指標的考察，其中，在低食物血糖生成指數(GI值)的食物篩選中應用較多。徐箐等[21]將體外模擬消化技術應用于低GI值淀粉原料的篩選方面，運用體外模擬胃腸道消化對不同種淀粉消化前后水解率進行測定，分析了不同淀粉體外消化特征，得到豆類及豆類制品GI值較低，大米谷物類GI值較高，其中豌豆淀粉、鷹嘴豆淀粉預測血糖生成指數(eGI值)顯著低于白面包的，屬于低eGI淀粉。柳芳偉等[22]以高筋面粉、黃豆等為主要原料并添加一定量的膳食多糖制作面包，考察不同含量多糖的面包體外消化情況，比較不同樣品經體外模擬消化后的淀粉含量，通過測定淀粉水解率，進而探究其GI值和血糖負荷指數(GL值) 。黃強等[23]對玉米淀粉進行了體外消化，檢測了玉米體外消化后葡萄糖含量，并分析了淀粉熱力學性質與消化性的關系。

3.2 體外模擬消化技術在多酚類物質中的應用

多酚是以苯酚為基本骨架的具有多元酚羥基結構的一類活性物質[24]，具有抗氧化性、抗菌消炎等多種功能特性。倪香艷等[25]研究表明，體外消化能夠顯著增加糙米中酚類物質的釋放，其中口腔消化過程中多酚類物質增加量較少，胃消化階段多酚類物質增加量最多，腸道消化階段中其含量呈緩慢增加趨勢。Maiara等[26]考察了咖啡中酚類化合物的消化變化，將樣品溶液分別置于模擬人體口服、胃腸道消化階段，揭示了多酚類化合物的生物可及性和抗氧化特性。Ma等[27]分別采用口腔、胃、腸道3種連續(xù)消化模型對豌豆殼進行體外消化研究，闡述了多酚類物質在體外消化過程中的釋放過程及其主要影響因素。

3.3 體外模擬消化技術在維生素中的應用

維生素是體內發(fā)揮重要作用的一類活性物質，通過體外模擬消化研究其活性變化的實例較多。Liu等[28]對添加了蝦青素的長鏈甘油三酯油進行了消化后脂肪酸含量測定，通過模擬人體口腔、胃腸消化過程，考察消化前后脂肪酸含量的變化，初步評估了蝦青素在食品和營養(yǎng)保健品的作用效果。在類胡蘿卜素消化研究中，大多數類胡蘿卜素的體外消化模型都忽略了口腔消化，只模擬了胃、腸兩個消化過程，可能是因為口腔對類胡蘿卜素消化的影響較小。Garrett等[29]分析了葉黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素在胃、腸消化過程中的膠束化率。研究[30]表明：胃環(huán)境對類胡蘿卜素的消化影響較小，腸環(huán)境是其主要的消化階段。杜佳等[31]選用粗壯脈紋孢菌的類胡蘿卜素，經體外模擬消化測定其釋放率，采用口腔消化、胃模擬和小腸模擬消化過程，觀察消化前后孢子的形態(tài)并檢測其抗氧化能力。此外， Perez-Vicente等[32]研究了石榴汁中維生素C在模擬的胃、腸中的消化狀況，確立了用濃鹽酸和碳酸氫鈉調節(jié)消化環(huán)境的pH值，選用胃蛋白酶、胰液素和膽汁鹽為消化酶系的消化模型，經紫外分光光度法和高效液相法檢測，結果顯示經模擬的胃腸道消化后在胃腸液中存有一部分具有生物活性的維生素C[33]。

3.4 體外模擬消化技術在蛋白質中的應用

蛋白質也是人體重要的營養(yǎng)物質之一。Abdel-Aal等[34]研究表明，蛋白酶的種類及酶作用順序與過程會對蛋白質的消化率產生影響。選用胰蛋白酶、糜蛋白酶和肽酶同時消化蛋白質，與采用胃蛋白酶和胰液素分兩步消化蛋白質試驗組進行對比，就蛋白質的消化率而言，前者比后者高了39%～66%。Wang等[35]采用體外模擬消化技術對大麻蛋白質消化前后成分變化進行了測定，該方法也適合于燕麥全粉蛋白質體外消化的測定[36]。Marcela等[37]發(fā)現，發(fā)芽大豆蛋白經體外模擬消化后產生了具有抗炎、抗癌效果的活性肽。體外模擬消化也適用于純品的消化情況分析，岳穎等[38]對提取得到的小麥蛋白肽進行了體外模擬消化試驗，檢測其消化前后分子質量分布情況。

3.5 體外模擬消化技術在食品和土壤污染物檢測中的應用

隨著時代的快節(jié)奏發(fā)展，在工業(yè)和農作物中相繼出現不同程度的重金屬含量超標造成的食品污染問題。中國在場地健康風險評估和管理方面起步較晚，但隨著《污染場地風險評估技術導則》等標準的出臺[39]，健康風險評估技術體系日益完善，在各種暴露途徑中，經口攝入是人體重金屬暴露的重要途徑[40]，目前該途徑的評估基本以重金屬總量為依據，采用人體生物有效性為參數可以提高評估的準確性，污染物人體生物有效性的測定可借助于動物試驗來實現，但動物試驗存在費用高、周期長、重復性差和倫理方面等問題而未被廣泛應用。目前優(yōu)選的替代方法是采用體外消化方法測定胃腸液中可溶出的重金屬部分的生物可給性[41-43]，進而用于土壤重金屬健康風險評估分析。

陳廷廷等[44-48]應用PBET、DIN、IVG和UBM 4 種體外消化方法對土壤中重金屬含量進行了分析，多數重金屬生物可給性均是胃階段顯著高于小腸階段，但各種典型重金屬的生物可給性在不同體外方法中均沒有相對一致的規(guī)則。吳小飛[49]通過比較4種體外提取方法(UBM、PBET、SBET和IVG)對土壤重金屬的生物可給性發(fā)現，同一土壤的某種金屬的提取方法不同，其生物可給性不同；同一金屬選用同一方法提取時，由于主壤性質不同，其生物可給性也存在差異。因此，在評價重金屬對人體潛在危害時，必須綜合考慮土壤性質和金屬種類等因素，選擇合適的提取方法。利用SBET和PBET法分析食物對土壤重金屬生物可給性時發(fā)現，當胃中有面粉類食物和茶多酚時，重金屬鉛、銅、鎳和鋅的生物可利用率明顯降低；故考察富含重金屬的消化物時，其生物利用率與食物的化學性質、重金屬種類有關。Kiomars等[50]將體外消化模型應用于食用大米中砷、鎘、鉛等有毒金屬的生物利用率檢測，分析比較了生大米、熟大米和消化大米中有毒金屬含量，發(fā)現胃消化對毒性金屬的生物可給性顯著高于口腔和小腸消化過程。呂倩等[51]使用體外模擬消化技術對含有污染物鎘的大米和米線中鉻元素釋放情況進行了考察，不同的大米主食制品在不同的消化時間，鎘釋放量有顯著差異。綜上，體外模擬消化模型在金屬離子生物利用率測定方面已發(fā)揮著重要作用。

4 總結與展望

使用體外消化模型時，有些功能性成分如酚類物質的傳統(tǒng)提取方法采用有機溶劑浸提，但在食品應用中不可能加入有機溶劑，選用體內消化又有悖于倫理要求，因此體外消化模擬技術尤為重要，且其具有耗時短、可操作性強等優(yōu)點，被廣泛應用于檢測食物消化吸收情況。同時，體外消化模型的建立也存在著不可忽視的問題：① 體外消化模型是高度模擬體內消化過程，對比體外模擬消化過程與體內消化的一致性和準確性仍需進行大量實驗驗證。② 體外消化模型的通用性和兼顧性有待考察，多種樣品消化和純品消化所建立的消化模型不同，因此，不同的消化樣品需要改進模型各消化階段所用試劑的種類與用量，以達到更相近于體內消化過程。

關于體外模擬消化，除使用試劑模擬消化環(huán)境外，還可使用體外模擬儀器，如采用動態(tài)消化模式，優(yōu)點是能夠較為系統(tǒng)地模擬口腔、胃、腸道消化過程，獲得中產物和終端代謝物，可連接高效液相色譜儀、分光光度計等對食物中分解物進行分析檢測。目前，體外消化模型在食品、藥品以及保健品等行業(yè)有著至關重要的作用，后續(xù)可結合體外模擬消化技術與設備的共同作用，不斷完善體外消化模型的各項參數，將體外模擬消化技術推向更廣闊的發(fā)展空間。