穿龍薯蕷莖段組培體系的建立

黨裳霓, 劉 影, 高潤梅

(山西農業大學林學院， 山西 太谷 030801)

穿龍薯蕷(Dioscoreanipponica)為薯蕷科(Dioscoreaceae)多年生纏繞草質藤本，廣泛分布于我國東北、華北、西北(除新疆)及河南、山東、安徽、浙江、江西 (廬山) 、陜西 (秦嶺以北) 、四川等地[1]。其根狀莖是提取藥用成分薯蕷皂甙的重要原料[2]。目前對藥源材料的需求持續增加，但穿龍薯蕷野生資源量日趨減少，已處于瀕危狀態，屬國家二級保護植物[3]。生產上雖可通過根狀莖繁殖或播種的方法解決對藥源材料的需求，但人工栽培存在許多不足，如以根狀莖繁殖，不僅要消耗大量的根狀莖，而且難以保證藥材質量，繁殖速度較慢，人工栽培一般3年后采收；如采用種子進行繁殖，不僅萌發率低，苗期長，且定植5年后才可采收[4-6]。組織培養技術已廣泛應用于植物良種培育與快速繁殖，為穿龍薯蕷的大規模種植開辟了新途徑，對解決生產中種苗缺乏的突出矛盾，提高穿龍薯蕷的產量和品質具有重要意義[7]。本試驗以穿龍薯蕷幼嫩帶節莖段為試材，分析消毒時間、培養基激素配比對該種腋芽誘導、繼代培養和生根培養等的影響，以期建立穩定、高效的穿龍薯蕷離體再生體系，實現穿龍薯蕷生產的產業化，促進穿龍薯蕷種植產業的健康發展。

1 材料和方法

1.1 植物材料

穿龍薯蕷植株引種自山西省陽城縣蟒河國家級自然保護區，2015年春栽種于山西農業大學林學院苗圃。

2016年6月，取生長健壯的穿龍薯蕷植株幼嫩莖段，剪成長1.5～2 cm的帶芽莖段，置于飽和洗衣粉溶液的燒杯中清洗后流水持續沖洗30 min，再用蒸餾水沖洗3遍。將供試材料放入超凈工作臺進行消毒[8]。

1.2 外植體消毒

75%酒精外植體表面消毒30 s后，以0.1% HgCl2進行消毒處理，分別設置3 min、5 min和8 min的處理時間，比較不同時間處理的消毒效果。接種30 d后，統計莖段的褐化死亡率、污染率和萌芽率。其中外植體無污染、未褐變視之為成活，之后有效回收HgCl2[9]。

1.3 莖段離體培養

試驗所用的培養基中均添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH調至6.0，121 ℃高壓滅菌30 min。所有培養物均于(25±1)℃的恒溫培養箱中培養，光照強度1 500 lx，光暗各12 h。

1.3.1誘導培養基激素配比

采用3因素3水平的正交試驗設計。3個因素為基本培養基、NAA、6-BA，其中，選取3種培養基MS、B5、1/2 MS；NAA選取0、0.1 mg·L-1和0.2 mg·L-13個濃度水平；6-BA選取0、1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-13個濃度水平，試驗共有9種組合培養基。外植體按適宜消毒時間處理后，分別接種于上述9種培養基中，每種培養基接種20瓶，每瓶接種3個外植體，接種30 d后統計莖段的污染率、褐化死亡率及萌芽率。

1.3.2增殖培養基激素配比

采用2因素3水平實驗設計。將初代培養得到的瓶苗剪成1～2 cm帶一葉一節的莖段轉接到增殖培養基中。2因素為NAA、6-BA，其中，NAA選取0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1和0.3 mg·L-13個濃度；6-BA選取1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1和3.0 mg·L-13個濃度水平，試驗共有9種組合。每個處理方式接種20瓶，每瓶接種3株。以30 d為1個繼代周期，繼代3次后轉入生根培養基，統計增殖系數和叢生芽數，觀察芽的長勢。

1.3.3生根培養基激素配比

以1/2 MS為基本培養基，添加不同濃度的IBA、6-BA、NAA于培養基中，進行生根培養。將生長至3～4 cm長勢較為健壯的芽苗轉入不同生根培養基中進行根誘導。其中，NAA選取0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-14個梯度；6-BA濃度設置為1.0 mg·L-1；IBA濃度設置為0.5 mg·L-1。每種培養基接種30瓶，每瓶接種3株，60 d后觀察不同處理之間的生長狀況、生根率、根數、根長及株高情況。

1.3.4瓶苗移栽

由于組培苗幼嫩，一直處于可控的環境下生長，抗性較低。所以移栽前要先煉苗，提高其成活率。

將生根培養后生長良好的試管苗移至(25±1)℃、50%～70%遮陰度的大棚內，進行光培煉苗，自然光下閉瓶煉苗3 d[10]。再將封口膜取下2～3 d，煉苗過程中，每天選擇光照弱的時候通風2次，每次30 min[11]。取出幼苗，洗去根部瓊脂，移栽于蛭石∶腐殖土∶河沙=1∶1∶1的基質中[12]。并在移栽后滿足組培苗所需水分，保持較高的濕度，每天噴霧噴施適量水，20 d后統計移栽成活率。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel、SPSS、DPS軟件對試驗數據進行統計分析，顯著水平為0.05和0.01。

2 結果與分析

2.1 消毒時間對外植體的影響

以污染率、褐化死亡率和萌芽率為評價指標，分析0.1% HgCl2不同消毒時間對外植體的影響，見表1。

表1 消毒時間對外植體滅菌效果的影響

由表1可知，HgCl2消毒不同時間，對萌芽率的影響達顯著水平(p<0.01)，隨著滅菌時間的增加，污染率逐漸降低，在5 min時外植體萌芽率最高(83.33%)。由于材料較幼嫩，消毒時間繼續延長，外植體褐化死亡現象加重，萌芽率顯著下降，在8 min時死亡率達36.67%，萌芽率降到58.33%。可見，以0.1% HgCl2作為腋芽誘導外植體消毒溶液，消毒時間以5 min為宜。

2.2 蕷莖段腋芽誘導NAA與6-BA濃度的優化

以萌芽率為評價指標，結合腋芽生長情況，分析不同處理對腋芽萌發的影響，結果見表2。

表2 不同濃度NAA與6-BA組合對腋芽萌發的影響

由表2可知，基本培養基類型、2種外源激素NAA和6-BA的濃度對腋芽誘導效果存在顯著差異(p<0.01)，2.0 mg·L-16-BA對腋芽萌發的效果較好，1.0 mg·L-1次之。在MS、1/2 MS和B5培養基中，2.0 mg·L-16-BA時萌芽率較高，分別為86.67%、75.00%和73.33%。因此，在0～2.0 mg·L-1的6-BA濃度范圍內，萌芽率隨6-BA濃度增加呈上升趨勢，且MS培養基是腋芽誘導的適宜培養基。結合萌芽率和生長狀況等，不定芽誘導的適宜培養基為MS+0.2 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-16-BA，萌芽率為86.67%，且生長勢好，葉色濃綠。

2.3 腋芽繼代培養

對不同激素配比培養條件下不定芽的增殖情況進行極差分析，如表3所示。

由表3可知，6-BA對穿龍薯蕷再生苗的增殖影響大于NAA的影響。從不同處理的平均萌芽率(k)的大小可以看出，穿龍薯蕷不定芽增殖培養的適宜水平激素組合為 0.2 mg·L-1NAA+ 3.0 mg·L-16-BA，增殖系數為4.58；6-BA濃度為1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-1時，苗弱發黃，長勢較弱；6-BA濃度為3.0 mg·L-1時，不僅增殖率高，而且幼苗健壯，葉色淡綠，生長速度快。因此，較低的NAA/6-BA濃度比顯著促進穿龍薯蕷芽增殖。

表3 不同濃度NAA與6-BA組合對增殖系數影響的極差分析

2.4 生根培養

將經繼代培養后高達3 cm的小植株，接種于添加不同激素的1/2 MS生根培養基上。10 d左右開始出現白色根原基，20 d左右組培苗莖段底部逐漸出現白色根，一個月后小苗生根趨于穩定。

方差分析結果(表4)表明，添加單一激素NAA生根效果明顯優于其它處理。與其它處理相比，1號培養基生根效果最好，誘導的根系粗壯且生長較快，葉色濃綠，有明顯主根，生根率達到峰值73.34%。而對照的生根率僅次于1號培養基，說明在不添加外源激素的情況下，同樣可以誘導生根，生根率為60.02%，但根較細弱，葉色黃綠，無明顯的主根，多為須根。隨著NAA濃度增加，穿龍薯蕷根的長勢表現出先增后減的趨勢。NAA濃度為0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1時利于芽苗生根，濃度過高(1.0 mg·L-1)生根率會降低，影響生根效果。在NAA基礎上添加6-BA或IBA時，生根率低，且株高、根數和根長均低于含單一激素NAA(處理1、2、3)和對照。

表4 不同植物生長調節劑對生根培養的影響

生根后的幼苗在上述6種培養基培養10 d、20 d、45 d和60 d后，株高見圖1 。

由圖1可知，生根培養前20 d內，培養基濃度對幼苗株高影響差異不顯著(p<0.05)，但對培養45 d(C)和60 d(D)的幼苗株高存在顯著影響(p<0.05)。不同的培養時間段，1號培養基幼苗株高均高于其他5種處理：10 d的株高為2.48 cm，20 d的株高為5.05 cm，45 d的株高為7.51 cm，60 d時株高達8.68 cm，生長狀況最好，株高增幅顯著；其次是ck、2號和3號培養基；45 d和60 d幼苗株高1號培養基比ck分別高3.42 cm和4.02 cm。由此可見，生根率和生根情況以及平均株高可作為綜合評價組培苗的指標體系。在NAA基礎上，添加IBA和6-BA對促進芽苗生根的影響作用較小。

注：不同小寫字母示處理間在0.05水平上差異顯著。下同。

對60 d內不同濃度生根培養基的組培苗的根數和根長進行方差分析，結果見圖2。由圖2可知，不同組培苗之間生根數和根長存在一定差異。平均根數和根長在不同濃度的培養基間的差異顯著(p<0.05)。其中1號培養基的平均根數13.2條，而5號培養基僅3.4條(圖2 A)；1號培養基的根長達2.79 cm，而5號培養基根長僅0.8 cm(圖2 B)。因此，單一激素NAA與2種激素組合相比，前者誘導生根的效果明顯優于后者。由于穿龍薯蕷地下生物量和地上生物量成正比關系，NAA濃度為0.1 mg·L-1時，生根率達到峰值，株高、根數和根長增幅顯著，生長狀況較好。因此適宜生根培養基為1/2 MS+0.1 mg·L-1NAA。

圖2 不同濃度的激素組合對生根數和根長的影響

2.5 瓶苗移栽

本次試驗選用腐質土∶蛭石∶河沙=1∶1∶1混合物作為移栽基質，煉苗后移栽時基質的選擇對組培苗能否成活起著重要作用。而腐質土、蛭石和河沙的混合物是較為理想的基質，通透性與保水性較好，將基質混合均勻且在121 ℃滅菌30 min。移栽初期，組培苗幼嫩，不適應新環境，呈現萎蔫狀態。移栽14 d左右，組培苗恢復正常，并長出1～2片新葉，長勢良好，移栽存活率可達63.20%(見圖3)。

注：A為初代培養芽誘導(MS+0.2 mg·L-1 NAA+2.0 mg·L-1 6-BA)；B為第1次繼代培養(MS+0.2 mg·L-1 NAA+3.0 mg·L-1 6-BA)；C為第2次繼代培養 (MS+0.2 mg·L-1 NAA +3.0 mg·L-1 6-BA)；D為第3次繼代培養(MS+0.2 mg·L-1 NAA+3.0 mg·L-1 6-BA)；E為生根培養(1/2 MS+ 0.1 mg·L-1 NAA )；F為移栽成活的試管苗。

3 討論與結論

3.1 討 論

對于處于瀕危狀態的物種通過組織培養技術進行大規模繁殖，利于其種質資源的保存，但不同的物種其培養條件各異[13]。

取大田栽培的穿龍薯蕷地上幼嫩帶節莖段，較難獲得無菌外植體。消毒時間的選擇也需謹慎，因為材料較幼嫩，若消毒時間過短，則會出現大面積的污染，從而失去寶貴的試驗材料，增加成本；若消毒時間過長，雖可降低污染率，但同時會導致接入培養基后存活率的降低或抑制其生長，加重外植體死亡與褐化現象的發生[14]。且HgCl2毒性大，易殘留，環境污染風險高，對使用和回收要求高[15-16]。

生長素和細胞分裂素相互配合在植物離體培養中能夠對細胞的分裂與分化、形態建成、控制器官的分化均有著重要的調節作用[17]，并且不同組培階段所需的外源激素種類、濃度和配比不完全相同，對試驗結果有相當大的影響[18-20]。在一定濃度范圍內，細胞分裂素與生長素的濃度比是關鍵指標，對芽與根的萌發與發育有重要的影響。生長素與細胞分裂素比值高時，會導致植株的膨大生長，減弱芽生長，利于生根，比值較低時相反[21]，有研究甚至提出對帶芽莖段萌芽率誘導的比值為10時，腋芽萌發率最高[22]。本研究中，細胞分裂素對芽誘導和芽增殖影響顯著，而生長素對2個培養階段無明顯影響。芽誘導的適宜培養基NAA和6-BA激素濃度的比值為10。根誘導是植物組織培養過程中的關鍵環節，只有誘導出健壯、發達的根，組培苗才能成功移栽。本次試驗中，通過比較生根率、根數和根長，并結合組培苗的株高與生長狀況，認為單一激素NAA的生根效果優于2種激素組合。

光是植物生長不可缺少的條件，光照強度對植物生長率、葉片數量和株高有重要意義[23]。研究表明，光照強度低時，植物會通過消耗自身的物質來擴大接收光能的面積，同時光合作用的速度減慢，光合作用產物的積累變少，不利于植物生長[24]。由于光照強度影響光合色素合成，葉綠素含量與葉色顯著相關[25]。因此，光照強度對植物組培苗的影響主要體現在苗色變化上[26]。本研究發現，穿龍薯蕷腋芽誘導的芽苗轉接到增殖培養基后，苗色由深綠變為淺綠。芽苗繼代培養與初代培養相比，需要更強的光照，本試驗的苗色變化可能是由光照強度減弱引起的，所以一個繼代周期后，選擇透光性好的培養瓶，芽苗接收光照更充分，苗色逐漸恢復。

3.2 結 論

本研究以穿龍薯蕷幼嫩帶芽莖段為外植體，通過對消毒時間、誘導培養基、繼代培養基和生根培養基激素配比進行對比優化，構建莖段再生體系如下：

1) 以0.1% HgCl2作為腋芽誘導外植體消毒溶液的消毒時間以5 min為宜。

2) MS+0.2 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-16-BA為誘導腋芽的適宜培養基。

3) MS+0.2 mg·L-1NAA+3.0 mg·L-16-BA芽增殖分化效果好。

4) 1/2 MS+0.1 mg·L-1NAA為適宜生根培養基。

5) 腐殖土∶蛭石∶沙河=1∶1∶1作為移栽基質，幼苗成活率高。