TTC法快速測定南京椴種子生活力的研究

朱思宇， 周思雨， 祝 燕， 李吉春， 談建中

(1.蘇州大學建筑學院風景園林系， 江蘇 蘇州 215123； 2.蘇州園林發展股份有限公司， 江蘇 蘇州 215008)

南京椴(TiliamiquelianaMaxim.)為椴樹科(Tiliaceae)椴樹屬(Tilia)高大落葉喬木，為我國特有種。南京椴集觀賞價值、經濟價值及藥用價值于一身，綜合利用價值很高。南京椴資源的開發利用正日益受到重視[1]，但其苗木繁殖比較困難，資源不充足，目前種子繁殖仍是其最常用的繁殖方式之一。研究表明，南京椴種子飽滿程度各不相同，又具有深度休眠特性[2]，持續可達2～3年甚至更久，因此無法通過發芽率試驗判斷種子質量的優劣。種子生活力是指種子發芽的潛在能力和種胚具有的生命活力，是判定種子質量好壞的重要指標之一[3]，其中TTC法測定種子生活力已成為國際通用種子檢測方法[4]，適用于絕大多數種子，具有快速、有效、準確的特點[5]，但在南京椴種子生活力測定中的應用研究目前尚少見報導。另一方面，南京椴種子由于種皮致密堅硬、透水性差，即使在溫水中浸泡一周仍然堅硬，很難切取種胚進行生活力測定，這是TTC法快速測定南京椴種子生活力時需要解決的實際問題。為此，本研究采取不同的種皮處理方式對南京椴種子TTC染色活力進行了測定，并選擇TTC濃度、染色溫度與染色時間三因素進行了正交試驗，以優化TTC法快速測定南京椴種子生活力的技術條件，為南京椴種子質量鑒定與種苗生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的南京椴果實在泥炭土∶蛭石∶黃沙=1∶1∶1的基質中層積催芽4個月，取出果實清洗干凈后，用錘子輕擊果實、剝去果皮，取出完整種子用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1種皮處理

選取外觀完好的南京椴種子，分4種方法對種皮進行處理： 1) 使用解剖刀小心剝去種皮(去皮處理)； 2) 在種子側面小心切出一個缺口，露出胚乳(切刻處理)； 3) 使用錘子輕擊種皮至產生一道裂口(裂口處理)； 4) 種子種皮不做任何處理、直接浸漬于蒸餾水(對照組)。每個試驗區均設置3個重復，每次取種子15粒。

1.2.2種子浸漬處理

將上述4種不同種皮處理的南京椴種子浸漬于蒸餾水，置室溫下使其充分吸水。其中，對照組種子浸種過夜后，種皮仍很堅硬，無法用解剖刀切開，表明種胚尚未充分吸水；持續浸種10 d后可用解剖刀進行縱切，表明種胚及胚乳已充分吸水。其余各處理區種子浸種過夜后均充分吸脹。

1.3 TTC染色

將浸泡吸水完全的南京椴種子在鋪有吸水紙的硬板上，用解剖刀沿縱向將種胚中央切開，取出有種胚的一半放于培養皿中，倒入濃度為0.15%的TTC染液(現用現配)，浸沒種子，于30 ℃恒溫培養箱中黑暗條件下染色40 min。

各個試驗區的種子染色結束后，取出種子立即用清水清洗，觀察染色情況。其中，種胚全部被染為紅色與淡紅色，或者胚軸染成淡紅色、且胚頂端或兩端被染成紅色的即判定為有生活力的種子。

1.4 正交試驗設計

在上述試驗結果的基礎上，選取TTC濃度、染色溫度和染色時間作為影響種子生活力測定準確性的主要因素，設計L9(33)正交試驗(表1)，進一步優化南京椴種子TTC染色檢測方法。

表1 南京椴種子生活力測定條件正交試驗的因素和水平

1.5 調查項目及數據處理

種子飽滿度(%)=(獲得種子個數/供試果實個數)×100%；

種子生活力(%)=(有生活力的種子數/供試種子總數)×100%；

采用SPSS 23軟件對數據進行統計分析，判斷各種皮處理組之間的差異。

2 結果與分析

2.1 南京椴成熟果實的種子飽滿度調查

供試南京椴果實經層積催芽后，取出清洗干凈、記錄所取果實數，并用錘子輕擊果實，剝去果皮，取出的種子按單粒(果實發育1個完整飽滿種子)與復粒(果實發育2個完整飽滿種子)、飽滿與空癟(果實未發育成完整飽滿種子)等不同情況進行調查，分析種子飽滿度情況，結果如表2所示，三批果實的種子飽滿度平均為64.7%?？梢?，供試的南京椴果實在層積催芽4個月后其種子飽滿度并不高。

表2 供試果實的種子飽滿度

2.2 種皮不同處理對南京椴種子生活力測定結果的影響

由表3可見，未處理對照組的種子不但需要長時間浸種，且種子生活力也較低，僅31.1%，很難準確判定種子生活力的實際情況；去皮處理組由于種皮堅硬，去皮處理難度很大，耗時耗力，種子生活力僅為20.0%，顯然也不能準確判定種子生活力的情況；與此相比，切刻處理組與裂口處理組測得的種子生活力較高，分別為80.0%與64.4%，兩者的處理效果無顯著差異，但與另外兩組的處理結果之間的差異顯著。

表3 南京椴種皮不同預處理種子生活力測定結果

2.3 南京椴種子生活力TTC測定方法的優化

南京椴種子經種皮不同處理后，在染色試驗過程中普遍出現染色較淺的現象；推測可能與TTC染色效果的影響因素有關。為此，在分析前人研究結果的基礎上，選擇TTC染色液濃度、染色溫度及染色時間3個主要因素進行了正交試驗，以優化TTC染色法的技術參數，結果如圖1和表4所示。

表4 南京椴種子TTC速測法的正交試驗結果

在不同因素與水平組合處理下，南京椴種子生活力介于76.7%～96.7%之間，存在較大差異，其中以0.2%TTC、40 ℃、染色2 h條件下種子生活力最高，染色效果也最好(圖1)，明顯優于其他處理組合；而組合0.1%TTC、30 ℃、染色1 h條件下種子生活力最低，染色較淺，效果較差(表4)。

注：A為染色條件為0.15%TTC、30 ℃、染色1 h，染色較淺； B為優化處理Ⅴ，染色條件為0.15%TTC、30 ℃、染色2 h；C為優化處理Ⅶ，染色條件為0.2%TTC、40 ℃、染色2 h。

方差分析結果(表5)表明，3個因素中，染色溫度和染色時間對生活力測定具有顯著影響(p<0.05)，TTC濃度對生活力測定影響不顯著(p>0.05)。三者對南京椴生活力的影響程度從大到小依次為：染色時間、染色溫度、TTC濃度。

表5 南京椴種子生活力測定正交試驗的方差分析結果

3 討 論

種子生活力對于快速檢驗植物種子的質量具有重要指導意義[6]，但因南京椴種皮堅硬、透水性差，很難快速、準確判斷其種子生活力。為此，本研究首先調查了4種不同的種皮處理方式對種子生活力測定的影響，發現種皮不同預處理方法對種子染色速度和生活力測定值具有顯著影響，其中未處理對照組的種子短期內很難充分吸脹，導致種子生活力測定的結果不夠準確，去皮處理浸種12～15 h后，種子活力明顯偏低，也不能作為判斷的依據，且去皮處理費時費力；而裂口處理或切刻處理進行浸泡不僅處理相對簡單、浸泡時間大大縮短，結果也相對準確。尤其是切刻處理方法能確保種胚完整不受損傷，結果準確，可以認為這是快速、準確測定南京椴種子生活力的有效處理方法之一。

染色濃度、染色溫度以及染色時間是TTC法快速測定種子生活力的主要影響因素[7]。本研究采用正交試驗方法，篩選南京椴種子生活力TTC測定的適宜條件。結果表明，隨著染色濃度、染色時間與染色溫度的優化，TTC法可以快速、準確地測定南京椴種子生活力。其中采用0.2%TTC、染色溫度40 ℃、染色時間2 h組合處理時，其種胚染色效果較好，表現為染色程度較深，種子生活力高達96.7%，可以認為這是南京椴種子生活力TTC速測法的優化條件。

采用TTC速測法獲得的南京椴種子生活力并不低，明顯高于實際生產中的發芽率，這是因為南京椴果實的種子飽滿度各不相同，有的果實內沒有發育完全的種胚(空癟種子)，有的因層積催芽持續時間較長而霉爛變質。另一方面，南京椴種子自身存在的機械障礙和胚乳中含有抑制萌發的物質[8-9]，使得種子成熟后早期的發芽率較低。因此，本研究的南京椴種子生活力TTC速測法雖然具有快速、簡便、準確等優點，可用于評估南京椴種子的潛在發芽能力，但同時還需要考慮層積催芽方法對發芽率的影響，將兩者結合起來可更好地應用于播種育苗生產。