牦牛ACAA2基因克隆及組織表達分析

陳 美 ，柴志欣 ，武志娟 ，王 會，王吉坤，王嘉博，鐘金城 ，信金偉

（1. 青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省、教育部重點實驗室，西南民族大學，成都 610041；2.青藏高原生態畜牧業協同創新中心，西南民族大學，成都 610041；3.省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，拉薩 850000）

牦牛（Bos grunniens）別名旄牛，是主要分布于青藏高原海拔3 000～5 000 m 高寒高原的草食性反芻動物，我國牦牛數量占世界牦牛總數95%，因分布區生態環境、地理分布及人文經濟各異，形成不同地方品種及類群[1-2]。類烏齊牦牛主要分布于西藏自治區東北部類烏齊縣[3]，位于海拔4 500 m以上高山草甸草原地區，是當地優良牦牛遺傳資源，以產肉為主、肉乳兼用型牦牛。麥洼牦牛主要分布在海拔3 000 m以上高山草甸草原，是肉乳兼用的優良地方品種，產肉量高，是典型利用肉質優勢優良牦牛品種。牦牛肉是一種高蛋白、低脂肪、高能量的優質肉資源，牦牛肉氨基酸含量高于黃牛肉[4]，是高原牧區農牧民主要食用肉類和經濟來源。因此，如何利用牦牛肉質優勢資源，提高牦牛產肉量及肉品質，是目前牦牛定向育種重要研究方向。

乙酰輔酶A 酰基轉移酶（Acetyl-Coenzyme AAcyltr-ansferase，ACAA）包括乙酰輔酶A 酰基轉移酶1（Acetyl-Co A AcyltransFerase 1，ACAA1）和乙酰輔酶A酰基轉移酶2（Acetyl-coenzyme Aacyltransferase 2，ACAA2），屬于酰基輔酶A代謝酶超家族中硫解酶家族[5-6]，而ACAA2又稱線粒體3-羰基輔酶A硫解酶，是一種參與脂肪酸代謝過程酰基轉移酶，主要分布于線粒體[7]。研究顯示，ACAA2是脂肪酸氧化步驟中關鍵酶，催化脂肪酸氧化。李恒德等通過分析ACAA2 基因多態性發現，該基因在內含子8上存在一個SNP，且與日增重和眼肌面積均顯著相關[8]。李文娟采用基因芯片技術方法篩選和分析肉品質相關脂肪代謝功能基因，得出ACAA2是參與脂類代謝通路關鍵基因[9]。De Boer等采用基因組芯片技術分析不同小鼠脂質代謝組織表達譜發現，ZPZ 等基因存在差異表達[10]。Dio 等研究發現，脂蛋白脂肪酶（LPL）受體基因激活劑NO-1886在治療大鼠肥胖癥中發揮作用，可使ACAA2 mRNA表達水平增加1.49 倍，且LPL 活化劑NO-1886 可加速脂肪酸氧化相關酶表達，導致呼吸商（RQ）降低，為治療大鼠肥胖提供參考[11]。因此，ACAA2基因在肥胖、脂肪酸氧化或脂肪沉積等方面均發揮調節作用。

目前，關于ACAA2 基因相關研究在綿羊等物種中均有相關報道[12]，探究該基因與不同物種肉質性狀相關性。本研究通過克隆獲得牦牛ACAA2 基因cDNA 序列，檢測該基因在不同組織中表達情況，為該基因在牦牛脂肪合成、代謝等方面調控作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

分別選取3 頭健康6 月齡麥洼牦牛（四川省阿壩自治州紅原縣）和類烏齊牦牛（西藏自治區類烏齊縣），將其宰殺后，迅速采集其臀肌、胸肌、脾臟、肺臟、肝臟、心臟和腎臟組織，用DEPC水沖洗干凈，置于液氮中保存備用。

1.1.2 試驗試劑及儀器

YBR Premix Ex TaqTMⅡ和反轉錄試劑盒（Ta-KaRa）、 pMD19- T 載體（TaKaRa）、 DL- 2 000 Marker、Trizol（Invitrogen）、QuantStudio?3 實 時熒光定量PCR儀（Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取

采用Trizol法對所需組織進行總RNA提取，利用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計分別檢測RNA質量、濃度及D260 nm／D280 nm值，根據反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，并作為克隆和熒光定量模板。

1.2.2 引物設計及合成

根據GenBank 已公布黃牛ACAA2 基因mRNA全長序列（NM_001035342.2），利用Primer 5 設計ACAA2基因克隆引物（見表1），根據克隆所得序列設計熒光定量引物。引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 ACAA2基因克隆

PCR 擴 增 體 系 為15 μL： 2 × Taq Green PCR MasterMix 7.5 μL，上、下游引物各0.6 μL，模板cDNA 0.6 μL，最后加入5.7 μL ddH2O 配至15 μL。擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，退火溫度54 ℃，72 ℃延伸90 s，72 ℃終延伸5 min，35 個循環；1.0%凝膠電泳檢測其擴增產物，使用DNA 純化試劑盒作產物DNA 純化回收，將膠回收產物與pMD- 19T 載體16 ℃過夜連接， 轉化到DH5α 感受態細胞（大腸桿菌）中37 ℃、170 r·min-1震蕩培養1 h，復蘇后，將其涂布在含有Amp+的LB 培養基中，37 ℃培養12 h。從平板中挑取陽性菌落，置于含Amp+的LB 培養液中37 ℃、170 r·min-1震蕩培養10～12 h，將PCR 鑒定后的陽性菌液送至成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.2.4 ACAA2基因序列生物信息學分析

利用NCBI 中ORF Finder 程序分析牦牛ACAA2基因開放閱讀框；ExPASy中ProtParam預測該基因的理化性質；ExPASy中Prot ScaleNetPhos分析該蛋白疏水性/親水性；PSORTII Prediction 分析亞細胞定位；TMHMM 和SignalP 分別預測蛋白跨膜結構和信號肽；Net Phos 2.0 預測該蛋白磷酸化位點；SOPMA預測蛋白二級結構；SWISS-MODEL預測蛋白三級結構；Lasergene MegAlign 軟件作物種同源性序列比對。MEGA.7軟件中最大似然法（ML）構建系統進化樹；Graphpad prism 5 軟件繪制組織表達定量圖等。

1.2.5 ACAA2基因組織表達分析

利用克隆所得ACAA2 序列，設計實時熒光定量特異性引物。以GAPDH為內參基因，cDNA為模板，QuantStudio?3實時熒光定量PCR儀檢測ACAA2基因在各組織相對表達量。反應體系為10 μL：上、下游引物各0.4 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 3.2 μL，SYBR Premix Ex TaqTM(2×)5 μL。 反應程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。各樣本相對表達量結果用2-ΔΔCt法計算，利用SPSS 19.0 軟件單因素方差分析中Duncan法分析組織表達量顯著性。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

PCR 擴增以類烏齊牦牛臀肌組織cDNA 為模板，結果發現擴增產物的條帶清晰單一，長度為1 357 bp，與預期擴增片段一致（見圖1）。利用NCBI 中ORF Finder 作開放性閱讀框分析， 得出ACAA2 基因CDS 區序列長1 101 bp，共編碼366 個氨基酸殘基，序列已上傳至NCBI，GenBank 登錄號：MT861180。

2.2 理化性質分析

在分析ACAA2 蛋白的理化性質，發現該蛋白存在Ala 和Gly 含量最多，不含Pyl 和Sec。負電荷殘基總數（Asp+Glu）和正電殘基總數（Arg+Lys）均為37 個。蛋白分子式為C1686H2734N486O527S18，分子質量為38 822.27 u，理論等電點pI為7.07，親水性平均值為-0.127，脂肪指數為85.55，不穩定指數（Ⅱ）為40.88，說明該蛋白為不穩定親水性蛋白。

2.3 親水性/疏水性及亞細胞定位預測

在分析ACAA2蛋白疏水性/親水性過程中，發現ACAA2 信號蛋白最小值為-2.533 ，位于193位，其親水性最強；最大值為1.889，位于229位，其疏水性最強，說明此蛋白為親水性蛋白。在分析牦牛ACAA2 蛋白亞細胞定位過程中，發現ACAA2蛋白在細胞質中分布最多（47.8%）；其次為線粒體和細胞核（26.1%和17.4%）；在內質網和細胞骨架內分布較少，均為4.3%。

2.4 跨膜區與信號肽預測

分析ACAA2 基因編碼蛋白跨膜區與信號肽，發現牦牛ACAA2 蛋白即不存在跨膜區域，也無信號肽區域，說明該蛋白質即為非跨膜蛋白，也是非分泌蛋白。

2.5 蛋白磷酸化分析

預測ACAA2 蛋白磷酸化位點， 發現牦牛ACAA2 基因編碼氨基酸中共發現14 個絲氨酸（Ser）、10個蘇氨酸（Thr）和4個酪氨酸（Tyr）磷酸化位點。

2.6 二級和三級結構預測

預測牦牛ACAA2蛋白二級結構，發現ACAA2蛋白主要結構為α-螺旋154 個，占總鏈42.08%；其次為無規卷曲116 個，占總鏈31.69%；延伸鏈和β-轉角分別為64 個和32 個，占總鏈17.49%和8.74%。三級結構預測顯示，該蛋白主要以α-螺旋為主，與二級結構預測結果一致，且兩者序列一致性可達88.25%。

2.7 一致性比較與系統進化樹分析

將牦牛ACAA2 基因CDS 區序列與其他物種該基因CDS 序列進行同源性比對，發現牦牛ACAA2基因序列與黃牛、馬序列一致性較高，分別為92.0%和88.7%；與鼠類一致性較低，與家犬一致性最低（見表2）。由圖3可看出，牦牛與黃牛親緣關系最近，與馬和家犬親緣關系最遠，符合物種進化規律。

表2 各物種ACAA2基因序列的同源性比對Table 2 Homology alignment of ACAA2 gene sequence of each species

2.8 牦牛ACAA2基因組織表達分析

將麥洼牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌和臀肌7 個組織總RNA 按照反轉錄說明書反轉，獲得cDNA，以GAPDH 基因為內參基因，利用實時熒光定量PCR 分析麥洼牦牛7 個組織差異，發現牦牛ACAA2基因在以上組織中均表達（見圖4），且肝臟、腎臟與其他組織相比，差異極顯著，胸肌和臀肌中表達量最低。

3 討 論

隨著人們生活水平提高，人們對肉質口感要求也越來越高，牦牛肉與黃牛肉相比，口感和嫩度相對較差，但富含豐富蛋白質、氨基酸及微量元素，且具有脂肪低、熱量高等優勢，深受人們喜愛。影響牛肉品質感官指標包括色澤、肌內脂肪含量及肉質柔韌性等[13]，其中肌內脂肪（IMF）含量是主要影響因素[14]，脂肪含量又受脂代謝調控[15]，且關于IMF發育規律及脂肪沉積機制研究主要集中在肉牛[16]、雞[17]和豬[18]，在牦牛中研究相對較少。因此，如何提高牦牛肉品質和肌內脂肪含量也成為當前研究重點和熱點之一。

3.1 牦牛ACAA2基因序列特性

ACAA2主要分布在線粒體中，參與體外脂肪細胞分化，是脂肪酸β-氧化途徑關鍵酶，脂肪酸在β-氧化時產生乙酰輔酶A，在ACAA2作用下催化進入三羧酸循環徹底氧化，并釋放能量，維持細胞活性，從而參與脂肪酸代謝、調節線粒體細胞信號轉導、細胞凋亡信號等，為參與脂類代謝關鍵基因[19]。胰島素是脂肪生成主要調節因素之一，可促進肝細胞內葡萄糖合成糖原和儲存葡萄糖，但過量葡萄糖在肝臟中轉化為脂肪，影響脂肪合成基因表達。王倩倩等在探討ACAA2 基因與鵝肝脂肪代謝關系研究中發現，ACAA2基因表達與鵝肥肝形成密切相關，且在對鵝肝作不同濃度油酸、棕櫚酸和胰島素處理時，發現ACAA2 基因表達量均變化顯著[20]。

本研究成功克隆牦牛ACAA2 基因CDS 區序列，分析牦牛ACAA2 基因理化性質和亞細胞定位，發現ACAA2 基因主要在細胞質中分布，細胞質是新陳代謝主要場所，也是絕大部分物質中間代謝（如醣酵解作用、氨基酸、脂肪酸和核苷酸代謝）場所，說明ACAA2蛋白在新陳代謝方面發揮作用，且與脂肪酸代謝有關。對其磷酸化分析顯示，該蛋白磷酸化位點數量最多的是絲氨酸（Ser），絲氨酸可促進脂肪和脂肪酸新陳代謝，在肌肉組織合成過程中也發揮一定作用，此外，還是磷脂的主要成分之一，推測ACAA2可能調控牦牛脂肪代謝。

3.2 ACAA2基因在牦牛各組織中表達

分析ACAA2 基因在麥洼牦牛各組織中表達量，發現該基因在腎臟中表達量最高，其次是肝臟，在胸肌和臀肌中表達量最低。研究表明，研究固始雞×安卡雞F2資源群中胸肌IMF含量存在顯著差異的兩組極端樣品蛋白質學，發現ACAA2 基因在試驗個體對應的胸肌和肝臟中均高豐度差異表達[21]。在檢測ACAA2基因是否受脂肪代謝相關因子調控中，發現脂肪酸和胰島素均可顯著影響該基因表達[20]。熒光定量結果顯示，ACAA2基因在肝臟中表達量較高，推測該基因在肝脂肪代謝過程中發揮作用。腎臟具有重吸收水分、葡萄糖、蛋白質、氨基酸等作用，腎臟脂質含量與腎糖閾值（RTG）相關性研究發現，腎臟脂質沉積可能促進腎小管葡萄糖重吸收，導致尿糖排泄減少，且腎臟脂質沉積是造成RTG增高重要因素[22]，而該基因在腎臟中表達量最高，推測該基因在腎臟脂質沉積中發揮調節作用。此外，心臟可為機體供應氧和各種營養物質，且心肌脂質含量可作為肥胖患者心臟病生物指標和治療靶點[23]；對心力衰竭患者心臟活檢發現，心肌脂肪變性可能參與肥胖相關性心肌病變發生[24]。而本研究ACAA2在心臟和腎臟中表達量相對較高，也間接反映該基因在牦牛心臟、腎臟組織中與脂肪代謝相關性，同時ACAA2 參與線粒體能量代謝過程，為器官提供能量以維持其生理功能。

4 結 論

本試驗成功獲取牦牛ACAA2 基因CDS 序列，通過生物信息學分析，發現該蛋白是一種不具有信號肽和跨膜結構的不穩定親水蛋白，蛋白結構以α-螺旋為主，主要存在于細胞質中。系統進化樹和組織表達分析顯示，牦牛與黃牛親緣關系最近。與家犬親緣關系最遠，且ACAA2 基因在腎臟和肝臟組織中表達水平最高。