FGF-21緩解阿霉素誘導的大鼠心肌炎癥反應和凋亡作用機制研究

李德山 , ，王宗寶，康 凱，任桂萍，于 丹

（1. 東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2. 江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222002）

阿霉素（Doxorubicin，DOX）是臨床上用于治療各類惡性腫瘤的蒽醌類高效廣譜化療藥物[1]，但劑量依賴心臟毒性副作用限制其臨床應用，主要體現在心肌損傷[2]。近年來，針對阿霉素心臟毒性研究發現，DOX 誘導心肌細胞炎癥和凋亡方面在毒性機制中發揮重要作用[3]，包括激活心肌細胞凋亡信號通路，線粒體功能紊亂，心功能下降等，揭示該類疾病具有復雜的發病機制[4]。阿霉素可激活NF-κB 通路，引起下游如IL-6 等炎癥介質釋放，引發心肌細胞炎癥反應[5]。此外NF-κB通路激活也可能促進凋亡[6]，進一步引起心肌損傷。其他研究發現阿霉素可通過Nrf2 通路上調caspase-3 和bax表達，下調bcl-2表達，引起心肌細胞凋亡造成心肌損傷[7]。同時STAT3信號通路在心肌凋亡方面發揮重要作用，激活STAT3 通路可抑制阿霉素誘導的心肌細胞凋亡[8]，為緩解阿霉素毒副作用機制研究提供理論基礎。

成纖維細胞生長因子-21（Fibroblast growth factor 21，FGF-21）是由209 個氨基酸組成的內分泌蛋白[9]，目前，已知FGF-21 在降血糖[10]、降血脂、調節能量代謝、抗氧化應激、抑制炎癥[11]、抑制器官纖維化[12]和抑制血小板活化[13]等方面效果明顯。FGF-21可通過SIRT1/LKB1/AMPK信號通路抑制心肌細胞的氧化應激、炎癥和細胞凋亡[14]。除此之外，FGF-21緩解DOX誘導心臟毒性作用的機制與NF-κB 和STAT3 通路之間的關系尚無報道。本研究利用DOX 所誘導的大鼠心肌損傷模型，探究FGF-21 對該大鼠模型的保護作用，進一步探究FGF-21緩解DOX誘導的大鼠心肌炎癥反應和凋亡過程中發揮的作用，同時明確FGF-21緩解DOX誘導大鼠心肌損傷過程中對NF-κB 和STAT3 通路作用。本研究為FGF-21緩解DOX誘導大鼠心肌損傷預防機制研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

pSUMO-FGF-21重組質粒、E.coli Rosetta 表達菌株和H9C2細胞均保存自東北農業大學生命中心生物制藥實驗室；SUMO蛋白酶制于東北農業大學生命中心生物制藥實驗室[15]。

1.2 試劑與器材

鹽酸阿霉素（DOX）購自都萊公司；血糖儀、血糖試紙購自青島厚美德公司；Rat IL-1β、Rat IL-6和Rat TNF-α ELISA試劑盒均購自北京安迪華泰科技有限公司；兔抗bcl-2、Caspase-8抗體購自Abcam公司；兔抗β-actin抗體、兔抗bax抗體、鼠抗stat3抗體、兔抗P-stat3抗體、兔抗Caspase-3抗體、兔抗P-NF-κB 抗體、兔抗NF-κB 抗體和兔抗GAPDH 抗體購自Cell Signaling 公司；HRP 羊抗鼠抗體和HRP 羊抗兔抗體購自R&D；Western quick block kit 購自Genescript 公司；一抗稀釋液、二抗稀釋液和一抗二抗去除液均購自碧云天公司。

1.3 引物序列

Rat 引物序列由Sangon Biotech 合成： IL-6（ 上 游： AGCGATGATGCACTGTCAGA； 下 游：TAGCACACTAGGTTTGCCGA）， IL- 1β（ 上 游：GACTTCACCATGGAACCCGT； 下 游： GGAGACT GCCCATTCTCGAC），TNF-α（上游：GATCGGTCC CAACAAGGAGG；下游：GTGAGGAGCACATAGT CGGG）， GAPDH（上游： AGTGCCAGCCTCGTCT CATA；下游：GATG GTGATGGGTTTCCCGT）。

1.4 實驗動物

C57BL/6 雄性小鼠20 只，20～25 g，購自北京唯尚立拓科技有限公司，合格證號：NO.11036419 11001109，許可證號：SCXK（京）2016-0009；10月齡SD 雄性大鼠25 只，約230～270 g，購自長春億斯實驗動物有限公司。

1.5 方法

1.5.1 FGF-21蛋白發酵表達與純化

將pSUMO-FGF-21重組質粒轉化E.coli Rosetta表達菌，37 ℃過夜培養，挑取單菌落接種于氨芐抗性（100 μg·mL-1）20 mL LB 液體培養基，37 ℃培養6～8 h 后，SDS-PAGE 凝膠電泳檢測菌體上清中SUMO-FGF-21蛋白表達。按1%接種量接種于2個氨芐抗性（100 μg·mL-1）250 mL LB 液體培養基，120 r·min-1，37 ℃培養，當菌體OD600達到2時，作為發酵一級種子。以1%接種量接種于5 L 培養基發酵罐中培養，溫度37 ℃，pH 7，溶氧百分比為30%，當菌體OD600達到7時，取少量菌液制作蛋白樣品，溫度調至25 ℃，加入IPTG（0.25 mmoL·L-1）誘導培養6 h[16]。收集菌液，取少量菌液制作蛋白樣品，剩余菌液，溫度4 ℃，4 000 r·min-1離心，棄上清，將菌體沉淀用磷酸鹽緩沖液攪拌均勻倒入高壓勻漿機破碎，離心后收集上清并經中空纖維柱澄清。運用AKTA purifier100 純化系統純化，利用His Trap TM FF crude 親和層析柱一次親和得到SUMO-FGF-21， Hi Prep TM 26/10 Desalting脫鹽柱脫鹽后，加入SUMO 蛋白酶4 ℃過夜酶切。再利用His Trap TM FF crude 親和層析柱二次親和，脫鹽后得到成熟FGF-21 蛋白。15%蛋白凝膠電泳分析蛋白純化情況。

1.5.2 FGF-21蛋白活性鑒定

為檢測FGF-21 蛋白活性，糖尿病模型組和FGF-21組C57BL/6 小鼠按照100 mg·kg-1腹腔注射一次STZ，正常對照組注射等量生理鹽水，根據血糖變化情況每天測量血糖，直至高血糖趨勢穩定[16]。每日FGF-21 組注射FGF-21 蛋白，注射劑量為1 mg·kg-1。注射前和后2、4 h 分別取各組小鼠尾尖血，血糖儀檢測血糖。

1.5.3 心肌損傷大鼠模型建立

SD 大鼠隨機分成正常對照組（Control）、心肌損傷模型組（Model）、 FGF- 21 高劑量組（FH）、FGF-21 中劑量組（FM）、FGF-21 低劑量組（FL）5 組。利用PBS 將DOX 配制成2 mg·mL-1工作液，除Control組外其余各組SD大鼠于每周1、3、5、7日均尾靜脈注射2 mg·kg-1DOX 工作液，Control 組給予等量生理鹽水，同時FH、FM和FL組從第1次注射DOX 工作液開始每天腹腔注射FGF-21 蛋白，劑量分別為5、2 和1 mg·kg-1，注射4 周，直至大鼠處死[17]。處死大鼠時，取各組大鼠心臟組織，一部分心臟組織浸泡于4%多聚甲醛，一部分組織保存于-80 ℃；胸、腹腔積液2 000 r·min-1，4 ℃，離心10 min保存于-80 ℃。

1.5.4 Real-time PCR檢測炎癥因子轉錄水平取-80 ℃保存的各組大鼠心臟組織0.1 g，Trizol 法提取總RNA，反轉錄為cDNA，作Realtime PCR擴增，每組3個平行反應。具體循環參數為：95 ℃預變性10 s，95 ℃5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環后記錄數據。引物序列：IL-6（上游：AGCGATGATGCACTGTCAGA； 下游： TAGCACA CTAGGTTTGCCGA），IL-1β（上游：GACTTCA CC ATGGAACCCGT； 下游： GGAGACTGCCCATTCTC GAC），TNF-α（上游：GATCGGTCCCAACAAGGA GG；下游：GTGAGGAGCACATAGTCGGG），GAPDH（上游：AGTGCCAGCCTCGTCTCATA；下游：GAT GGTGATGGGTTTCCCGT）。

1.5.5 阿霉素誘導心肌損傷大鼠相關炎癥因子指標測定

取-80 ℃保存各組大鼠心臟組織0.1 g，加入1 mL生理鹽水勻漿，低溫離心機中2 000 r·min-1離心20 min后收集上清液體；取-80 ℃保存各組大鼠胸、腹腔積液，按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.5.6 Western blot檢測相關蛋白指標

取-80 ℃保存各組大鼠心臟組織約0.1 g，加入RIPA 裂解液1 mL，組織勻漿機充分勻漿，4 ℃裂解1 h 后，12 000 r·min-1離心10 min，收集上清。總蛋白經SDS-PAGE 分離后，轉移到NC 膜上，Western quick block kit 封 閉5～10 min， PBS 洗 膜5 s，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日，PBST洗膜3次，每次10 min，HRP標記羊抗兔二抗室溫避光孵育1 h（鼠抗stat3 抗體孵育的膜應用HRP 標記羊抗鼠二抗避光孵育1 h），PBST 洗膜3 次后化學發光法顯影，采用Image Lab 6.0軟件分析條帶。

1.5.7 HE和Masson染色病理檢測

處死大鼠時取各組大鼠心臟部分組織，浸泡于4%多聚甲醛，送南京中西醫結合醫院病理科作病理組織切片。

1.5.8 阿霉素誘導H9C2心肌細胞損傷模型建立

H9C2 細胞分成正常對照組（Control）、模型組（Model）、FGF-21 高劑量（80 μg·mL-1）組（FH）、FGF-21中劑量（40 μg·mL-1）組（FM）、FGF-21低劑量（20 μg·mL-1）組（FL）。利用生理鹽水將DOX配制成終濃度5 μg·mL-1工作液， FH、FM和FL組預先用FGF-21干預2 h，劑量分別為80、40 和20 μg·mL-1，Model 組與FH、FM、FL 組同時用5 μg·mL-1DOX工作液刺激H9C2 細胞22 h，Control 組用同體積生理鹽水處理[14]。利用各組細胞制作蛋白樣品，作Western blot檢測，具體步驟見1.5.6。

2 結果與分析

2.1 SUMO-FGF-21發酵表達

將一級種子接入發酵罐，37 ℃發酵培養4 h，25 ℃、0.25 mmoL·L-1IPTG條件下誘導培養6 h，通過蛋白凝膠電泳分析蛋白表達情況。結果見圖1，1號泳道誘導前菌種無SUMO-FGF21蛋白表達，2號泳道誘導后全菌有SUMO-FGF21蛋白表達，3號泳道誘導后上清有SUMO-FGF21蛋白表達，4號泳道誘導后沉淀有SUMO-FGF21 蛋白表達。SUMOFGF21蛋白發酵表達成功。

2.2 FGF-21蛋白純化

運用AKTA purifier100 純化系統純化FGF-21蛋白，結果如圖2 所示，1 號泳道為最終純化所得FGF-21蛋白，約23 ku，且無雜蛋白。

2.3 FGF-21蛋白生物學活性體內檢測

為鑒定FGF-21 蛋白活性，將純化所得FGF-21 蛋白注射于STZ 誘導的糖尿病小鼠模型體內，如圖3 所示，注射FGF-21蛋白前，糖尿病模型組和FGF-21組小鼠血糖水平無顯著差異。注射FGF-21蛋白2 h后，FGF-21組小鼠血糖濃度明顯降低，較糖尿病模型組差異極顯著（P＜0.01）。注射FGF-21 蛋白4 h 后，FGF-21 組小鼠血糖濃度明顯降低，較糖尿病模型組差異極顯著降低（P＜0.01）。結果表明，FGF-21蛋白降血糖蛋白活性較好。

2.4 FGF-21對阿霉素誘導后大鼠體重的影響

如圖4a 所示，造模前各組大鼠體重均處于相同水平。造模1個月后，與正常對照組相比，模型組、FGF-21 高、中和低劑量組大鼠總體重極顯著降低（P＜0.01）。如圖4b 所示，造模1 個月后，各組大鼠除去胸、腹腔積液，與正常對照組相比，模型組大鼠體重極顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，FGF-21 高劑量組大鼠體重降低緩慢，差異顯著（P＜0.05）。如圖4c 所示，與正常對照組相比，模型組大鼠胸、腹腔積液極顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，FGF-21 高劑量組大鼠胸、腹腔積液顯著降低（P＜0.05），FGF-21 中、低劑量組大鼠積液無顯著變化。FGF-21 呈劑量依賴性顯著緩解阿霉素誘導大鼠后體重降低，減少阿霉素誘導大鼠胸、腹腔積液產生。

2.5 FGF-21 對阿霉素誘導心肌損傷大鼠心臟TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達水平的影響

如圖5a 所示，與正常對照組相比，模型組大鼠TNF-α mRNA 表達水平極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比， FGF- 21 高劑量組大鼠TNF- α mRNA顯著降低（P＜0.05），與正常對照組水平無顯著差異，FGF-21中、低劑量組大鼠無顯著差異。如圖5b 所示，與正常對照組相比，模型組大鼠IL-1β mRNA 表達水平極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，FGF-21高、中劑量組大鼠IL-1β表達均顯著降低（P＜0.05），FGF-21 低劑量組大鼠無顯著差異。圖5c 所示，與正常對照組相比，模型組大鼠IL-6 mRNA 表達水平極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，FGF-21高劑量組大鼠IL-6表達顯著降低（P＜0.05），FGF-21 中、低劑量組大鼠無顯著變化。結果表明FGF-21可呈劑量依賴性降低阿霉素誘導大鼠心臟IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達。

2.6 FGF-21 對阿霉素誘導心肌損傷大鼠心臟TNF-α、IL-1β和IL-6表達的影響

如圖6a 所示，與正常對照組相比，模型組大鼠TNF-α 表達極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，FGF-21高、中、低劑量組大鼠TNF-α表達均顯著降低（P＜0.05），與正常對照組水平無顯著差異。如圖6b 所示，與正常對照組相比，模型組大鼠IL-1β 表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，FGF-21 高、中、低劑量組大鼠IL-1β 表達均顯著降低（P＜0.05）。如圖6c 所示，與正常對照組相比，模型組大鼠IL-6 表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，FGF-21高、中劑量組大鼠IL-6表達顯著降低（P＜0.05），FGF-21 低劑量組大鼠無顯著變化。結果表明FGF-21可有效降低阿霉素誘導大鼠心臟中TNF-α、IL-1β和IL-6表達，呈劑量依賴性降低大鼠心臟IL-6表達。

2.7 FGF-21對阿霉素誘導心肌損傷大鼠胸、腹腔積液中TNF-α、IL-1β和IL-6表達的影響

如圖7a 所示，與正常對照組相比，模型組大鼠積液中TNF-α 表達量極顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，FGF-21 高、中劑量組大鼠積液中TNF-α 表達量極顯著降低（P＜0.01），FGF-21 低劑量組大鼠TNF-α 表達量顯著降低（P＜0.05）。如圖7b 所示，與正常對照組相比，模型組大鼠積液中IL-1β 表達量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，FGF-21 高、中、低劑量組大鼠積液中IL-1β 表達量均顯著降低（P＜0.05）。如圖7c 所示，與正常對照組相比，模型組大鼠積液中IL-6 表達量極顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，FGF-21 高、低劑量組大鼠積液中IL-6 表達量顯著降低（P＜0.05）。結果表明FGF-21可呈劑量依賴性降低阿霉素誘導大鼠胸、腹腔積液中TNF-α、IL-1β和IL-6表達量。

2.8 FGF-21對阿霉素誘導心肌損傷大鼠炎癥蛋白和凋亡蛋白表達的影響

如圖8所示，與正常對照組相比，模型組大鼠bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-8、stat3和P-NF-κB 表達均顯著增加（P＜0.05），P-stat3 表達顯著降低（P＜0.05），bcl-2 表達無顯著差異；與模型組相比，FGF-21 高劑量組大鼠bax、cleaved caspase-3、stat3 和P-NF-κB 表達顯著降低（P＜0.05），P-stat3表達顯著增加（P＜0.05），cleaved-caspase-8 無顯著變化，FGF-21 中劑量組大鼠bax、cleaved caspase-3、stat3和P-NF-κB表達顯著降低（P＜0.05）， P- stat3 表 達 顯 著 增 加（P＜0.05），cleaved-caspase-8 無顯著變化，FGF-21 低劑量組大 鼠P- NF- κB 表達 顯 著降 低（P＜0.05）， bax、cleaved-caspase-3、 cleaved-caspase-8、stat3和Pstat3無顯著變化。結果表明FGF-21可呈劑量依賴性降低bax、cleaved caspase-3 和P-NF-κB 表達，增加P-stat3 表達，激活阿霉素誘導大鼠心肌損傷模型中STAT3 通路，抑制心肌細胞凋亡，同時抑制NF-κB信號通路，緩解心肌細胞炎癥反應。

2.9 FGF-21對阿霉素誘導大鼠心肌損傷的影響

如圖9 所示，與正常對照組相比，模型組大鼠左心室壁及心腔面有多處膠原纖維沉積，呈斑塊狀，局部心肌細胞缺失，周圍心肌細胞空泡變，并見少量炎癥細胞浸潤和組織細胞增生，左心室壁多處見藍染膠原纖維沉積；與模型組相比， FGF-21高劑量組大鼠左心壁肌間血管周圍纖維組織增多，周圍心肌細胞空泡變，有極少量炎癥細胞浸潤，血管周圍藍染區擴大；FGF-21中劑量組大鼠左心壁肌間見纖細網狀分布的成纖維細胞，周圍心肌細胞空泡變，有極少量炎癥細胞浸潤，藍染纖維呈纖細網狀；FGF-21低劑量組大鼠局部左心室壁極薄，心腔面和心包膜面大量纖維組織增生，存留中間少量心肌纖維。周圍心肌細胞變性，并見少量炎癥細胞浸潤，心腔面和心包膜面為藍染膠原纖維。結果表明FGF-21有效緩解阿霉素誘導的大鼠心肌纖維化損傷。

2.1 0 FGF-21 對阿霉素誘導H9C2 細胞炎癥蛋白和凋亡蛋白表達的影響

結果如圖10 所示。

由圖10 可知，與正常對照組相比，模型組細胞bax表達水平極顯著增加（P＜0.01），cleaved-caspase-3、cleaved-caspase- 8、NF-κB、stat3 和PNF-κB 表達水平顯著增加（P＜0.05），P-stat3 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，FGF-21高劑量組細胞bax、cleaved-caspase-3、cleavedcaspase-8、NF-κB、stat3 和P-NF-κB 表達水平顯著降低（P＜0.05），P-stat3 表達水平顯著增加（P＜0.05），FGF-21 中劑量組細胞bax、cleaved-caspase-3、stat3、NF-κB 和P-NF-κB 表達水平顯著降低（P＜0.05），P-stat3和cleaved-caspase-8表達水平無顯著差異，FGF-21 低劑量組細胞bax、stat3和P-NF-κB 表達顯著降低（P＜0.05）, cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-8、NF-κB和P-stat3無顯著變化。結果表明FGF-21 可激活H9C2 心肌細胞STAT3 通路，增加心肌細胞P-stat3 表達，下調bax、 cleaved- caspase- 3 和cleaved- caspase- 8 表達，抑制心肌細胞凋亡，同時抑制P-NF-κB 表達，緩解心肌細胞炎癥反應。

3 討論與結論

DOX 誘導心臟毒性發病機制涉及復雜的過程，涉及激活各種下游的促炎、促氧化和促凋亡過程[18]，嚴重可誘導心力衰竭，繼而發展成心臟疾病[19]。近年來研究者發現DOX 可增加IL-6 等炎癥因子mRNA 表達，上調炎癥因子蛋白表達，誘發H9C2心肌細胞炎癥，除此之外激活NF-κB信號通路也可誘發心肌炎癥[20]。同時DOX可通過TGF-β1/Smad3通路促進凋亡蛋白表達，誘導心肌細胞發生凋亡作用[21-22]。Zhang 等報道FGF-21 對抑制炎癥、抗氧化應激方面有較好效果[5]，通過激活Nrf2 抑制NF-κB 信號通路抑制巨噬細胞介導的炎癥反應，也可通過Nrf2通路保護小鼠肝臟[23]。在凋亡方面，FGF-21 也發揮重要作用，有氧運動可上調心梗大鼠內源性FGF-21 表達抑制H9C2 心肌細胞凋亡[24]，但在阿霉素誘導的心肌凋亡大鼠模型中，尚無FGF-21 與NF-κB 和STAT3 信號通路關系的報道。因此本研究利用DOX 誘導心肌損傷大鼠模型探究FGF-21 對NF-κB 和STAT3 信號通路的作用，并在細胞水平上開展相同通路探究，闡明FGF-21經NF-κB 和STAT3 信號通路緩解DOX 誘導的大鼠心肌損傷的作用。

本研究表明，在阿霉素誘導的大鼠心肌損傷模型中，FGF-21 可減少胸、腹腔積液和積液中炎癥因子表達，通過抑制NF-κB 信號通路抑制大鼠心肌炎癥反應，激活STAT3 信號通路抑制大鼠心肌細胞凋亡作用，預防心肌纖維化發生。本研究不僅為FGF-21臨床應用、阿霉素毒副作用預防與機制研究提供理論基礎，也為其他藥物性等原因心肌炎癥反應和凋亡作用的預防與機制研究提供參考。但本研究發現DOX 誘導的心肌損傷大鼠和細胞模型中，bcl-2 表達無明顯變化，與蘭蕊等研究指出DOX 誘導心肌病中bcl-2 表達下調變化不同[17]，同時心肌損傷大鼠模型出現胸、腹腔積液原因尚未明確，此為本實驗室未來研究主要方向。