南極菲爾德斯半島潮間帶沉積物細菌群落結構分析及產酶菌株初步篩選

吳蕾蕾 商麗 孫浩 史曉翀,2 張曉華,2

研究論文

南極菲爾德斯半島潮間帶沉積物細菌群落結構分析及產酶菌株初步篩選

吳蕾蕾1商麗1孫浩1史曉翀1,2張曉華1,2

(1中國海洋大學海洋生命學院, 山東 青島 266003;2青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋生態與環境科學功能實驗室, 山東 青島 266071)

為了研究南極菲爾德斯半島潮間帶沉積物細菌群落組成及可培養細菌產酶活性, 選取潮間帶19個站位沉積物樣品, 利用Illumina MiSeq高通量測序技術對沉積物中細菌的群落組成進行研究; 利用熒光定量PCR技術定量測量沉積物中總細菌的絕對豐度; 利用傳統的平板涂布法對16個站位的沉積物樣品中可培養細菌進行純化和鑒定, 同時選取38株細菌進行酶活性篩選。結果顯示: 19個站位潮間帶沉積物樣品共得到2 375個分類操作單元OTU(operational taxonomic unit), 共獲得42個細菌門, 其中變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)為優勢類群。總細菌的豐度介于2.51×107~6.65×108copies·g–1。對于可培養細菌, 129株測序的細菌分屬于4個門, 25個屬, 50個種。變形菌門、放線菌門、擬桿菌門為優勢類群, 這與高通量測序結果基本一致。選取其中38株進行酶活性篩選(包括脂酶、淀粉酶、明膠酶、褐藻膠酶和纖維素酶), 發現17株可產脂酶、24株可產淀粉酶、18株可產明膠酶、4株可產褐藻膠酶和4株可產纖維素酶。

菲爾德斯半島潮間帶沉積物 高通量測序 可培養細菌 16S rRNA基因 酶活性

0 引言

南極位于地球最南端, 全年冰雪覆蓋, 酷寒干燥、強光輻射, 土壤養分貧乏, 為典型的極端環境[1]。南極地區沒有大型植物以及大型食草類動物存在, 植物大多為地衣、苔蘚, 同時微生物也成為優勢物種[2]。南極微生物在極地生物地球化學循環中發揮重要作用, 并且在長期進化的過程中其生態特征及群落結構已經適應南極的極端環境[3]。因此研究該地區微生物多樣性有助于加深對南極生物地球化學循環過程的理解, 探究微生物在南極地區生物地球化學循環過程中發揮的作用, 同時為開發南極可利用的微生物資源提供基礎。

菲爾德斯半島位于南設得蘭群島的喬治王島西南端, 為無冰區, 屬于亞南極地區, 并受到海洋氣候的影響。在過去的50年期間, 多個國家在半島建立科考站, 大多數人類活動及陸地生物研究也都聚集在該半島。該半島的西海岸是重要的海豹棲息地, 東海岸設有多國考察站, 動物及人類活動對該地區的環境造成了一定程度的影響。前期對菲爾德斯半島細菌多樣性進行了一些研究, Xiao等[4]利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)的方式對長城站附近海水及土壤樣品細菌多樣性進行研究, 結果表明在土壤及海水樣品中有豐度較高的γ-變形菌綱 (Gammaproteobacteria)、放線菌綱 (Actinobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)。Zeng等[5]利用454焦磷酸測序對阿德雷灣及長城灣附近表層海水樣品微生物多樣性進行分析, 發現阿德雷灣樣品細菌可劃分為18個門類, 長城灣樣品細菌分屬于11個門類, 其中擬桿菌門、變形菌門為優勢細菌。在可培養方面, 楊曉等[6]對半島土壤樣品的細菌多樣性進行研究, 并闡述了人類活動及企鵝、海豹對細菌多樣性的影響。這些研究證實了盡管處于較為特殊的低溫環境中, 菲爾德斯半島的微生物群落仍有較高的豐度和多樣性。此外, 還有研究對可培養菌株進行低溫酶篩選, 獲得了產蛋白酶、脂肪酶等活性的菌株[7-8], 用于后續低溫酶的開發使用。然而這些研究僅通過非可培養或可培養單一方法闡釋了半島細菌群落組成, 通過高通量測序與傳統平板培養法結合來研究潮間帶沉積物環境樣品中細菌的群落組成的研究目前還很少。

本研究將2016年中國第32次南極科學考察采集的菲爾德斯半島潮間帶19個站位的沉積物作為研究對象, 通過高通量測序分析此地區細菌群落結構, 利用熒光定量PCR測定環境中總細菌豐度。同時利用傳統分離培養法對16個站位的沉積物樣品可培養細菌進行分離鑒定, 初步揭示潮間帶沉積物中可培養細菌的多樣性。同時選取其中38株分離的菌株進行產酶活性研究, 為開發極地低溫酶資源提供數據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本實驗所用樣品采自2015—2016年間南極菲爾德斯半島表層0~2 cm潮間帶沉積物。共獲得19個沉積物樣品, 其中西海岸7個樣品(W1~W7), 東海岸12個樣品(E1~E3, E5~E13)(圖1, 表1)。用無菌鏟鏟取適量沉積物樣品放入無菌自封袋中, 于-20℃冰箱保存, 返回實驗室后保存在-80℃冰箱用于后續DNA提取。選取16個站位的沉積物樣品(除E8、E11、E12), 稱取約1 g于15 mL 0.85% (w/v)的生理鹽水中混勻, 吸取100 μL于900 μL無菌生理鹽水中混勻, 吸取100 μL的渾濁液現場涂布于2216E(MA)、R2A培養基[9]上, 4℃培養, 返回實驗室進行分離和鑒定。

1.2 菌株DNA提取和高通量測序

取0.5 g沉積物(濕重), 使用E.Z.N.A土壤DNA取試劑盒(Omega, 美國)[10], 按照試劑盒操作說明進行總DNA提取并用凝膠電泳法和NanoDrop-2000分光光度計檢測DNA的濃度及質量。選取16S rRNA基因V4區, 利用引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對16S rRNA基因片段進行PCR擴增[11], PCR產物用Axy-PrepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen, 美國)進行純化與濃縮[12], 利用Illumina MiSeq平臺進行高通量測序。其中PCR擴增、純化和建庫由上海美吉生物醫藥有限公司完成, 測序所得原始序列上傳至NCBI數據庫, 登錄號為: SRP226771。

圖1 菲爾德斯半島潮間帶沉積物樣品采集站位圖

Fig.1. Sampling sites of intertidal sediment samples in the Fildes Peninsula

表1 菲爾德斯半島潮間帶沉積物樣品采集位點信息表

1.3 熒光定量PCR

本實驗室采用熒光定量PCR的方法進行細菌豐度的絕對定量。采用細菌通用引物515F/806R擴增目的片段。具體試劑及操作見參考文獻[13]。

1.4 數據處理

Illumina MiSeq測序得到的數據利用Mothur 軟件[14]進行去雜得到有效的序列。利用Usearch平臺將得到的有效序列進行OTU聚類, 并在97%的相似性水平下根據Silva數據庫進行物種的分類注釋。α多樣性通常包含Shannon指數、Chao1指數和Good’s物種覆蓋度等[15-17]。對于β多樣性, 在OTU的分類水平上基于Bray-Curtis距離進行非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)用于揭示樣品之間的聚簇, 并利用ANOSIM分析檢驗差異。利用Canoco 5.0軟件進行db-RDA分析以揭示物種聚類及其對環境因子的響應情況。東西部樣品物種分布的差異檢驗由IBM SPSS25.0完成, 利用非參數檢驗中的Mann-Whitney U檢驗方法進行計算, 同時利用相同方法與2012年本實驗室的分析結果進行比較分析[18]。

1.5 可培養菌株的分離鑒定及酶活驗證

根據顏色、大小、形態的不同挑取菌落, 三次劃線分離純化后利用酚氯仿法提取DNA[19]。利用細菌16S rRNA基因通用引物B8F/B1510進行PCR擴增[20]。PCR產物用限制性內切酶III酶切后進行 RFLP分析, 選取圖譜不同的PCR產物送北京六合華大有限公司測序[21]。通過EzBioCloud數據庫(https://www.ezbiocloud.net/)對測序結果進行比對, 確定菌株的分類地位[22]。對于淀粉酶、脂酶、明膠酶、褐藻膠酶及纖維素酶平板的配制及驗證方法參照文獻[23]。

2 結果與分析

2.1 細菌多樣性、豐富度和16S rRNA基因豐度

19個站位樣品高通量測序共獲得697 260條序列, 平均序列長度為273 bp, 樣品原始序列數在31 197~44 799之間, 抽平后序列數為27 791。97%相似水平下共獲得2 375個OTU, 菲爾德斯半島東部樣品的OTU數目(Mn=954)、Shannon指數(Mn=4.83)和Chao1指數(Mn=1205)普遍高于西部樣品(Mn分別為610、3.92、823)(獨立樣品t檢驗,<0.05)(表2)。每個站位的覆蓋度數值(Good’s Coverage)都在98%以上, 表示本研究的采樣可以較好地代表采樣區域的微生物群落組成。熒光定量PCR結果顯示, 西部區域的細菌豐度平均為3.49×108copies·g–1, W1站位細菌豐度最高, W4站位細菌豐度最低, 東部區域的細菌豐度平均為1.89×108copies·g–1, E11站位細菌豐度最高, 在E2、E3和E9站位細菌豐度較低。

表2 基于97%相似性水平下的OTU的多樣性、豐富度和16S rRNA基因絕對豐度

2.2 細菌群落組成

將19個站位的樣品測序結果經過優化后得到的OTU表格基于Bray-Curtis距離進行NMDS聚類分析(圖2), 可以發現沿著第一軸的方向上樣品按照東西部區域進行聚類(<0.05)。將細菌群落結構和環境因子進行db-RDA分析(圖3), 結果與NMDS一致, 各站位按照半島東西部分別進行聚類。其中經度是影響樣品聚類的最主要因素(=7.0,=0.002)(環境因子數據由中國海洋大學劉曉收老師提供)。

圖2 OTU水平上基于Bray-Curtis距離的NMDS

Fig.2. NMDS based on Bray-Curtis distance at the OTU level

根據Silva數據庫對所得的OTU序列進行分類學注釋。結果表明, 本實驗沉積物樣品共獲得42個門, 變形菌門占絕對優勢, 達到40%, 其次是擬桿菌門(30.15%)、放線菌門(18.39%)、浮霉菌門(Planctomycetes, 1.83%)。這4個門的微生物占總體比例的91.54%, 是南極菲爾德斯半島沉積物中的主要細菌類群(圖4)。在變形菌門中, γ-變形菌綱占據較大比例(占總體比例的30.09%), 其次為α-變形菌綱(Alphaproteobacteria, 7.36%)。α-變形菌綱的相對豐度在東部顯著高于西部(< 0.05), 且在E3站位相對豐度最高。擬桿菌門中占較高比例的為黃桿菌綱(占擬桿菌門的83.83%), 且東部區域的黃桿菌綱顯著低于西部區域(< 0.05)且在E2、E3和E9站位相對豐度較低。浮霉菌門、綠彎菌門(Chloroflexi)相對豐度在半島東部顯著高于西部(<0.05), 且在E9站位具有較高的豐度。

圖3 OTU水平上的db-RDA分析

Fig.3. The db-RDA analysis at the OTU level

圖4 豐度占總體比例的前0.5%門水平上的群落堆積圖

Fig.4. Bacterial community composition at phylum level of the more than 0.5% bacteria

在屬的水平上(圖5), γ-變形菌綱的顆粒狀球菌屬()占絕對優勢(總體比例的19.97%), 其次為黃桿菌科中的一個還未被分類的類群()(8.89%)。黃桿菌科的屬在東部站位普遍低于西部站位。α-變形菌綱的紅細菌科(Rhodobacteraceae)與γ-變形菌綱的伍斯氏菌科(Woeseiaceae/JTB255)豐度東部站位顯著高于西部站位。

2.3 可培養細菌多樣性及胞外酶活性測定

2016年, 從16個站位沉積物樣品共分離菌株473株, 經過酶切之后選取圖譜不同的129株細菌進行測序, 測序結果顯示這些細菌分屬于4個門, 25個屬, 50個種。豐度最高的為擬桿菌門(41株, 20個種), 其次為變形菌門(38株, 17個種)、放線菌門(31株, 8個種)和厚壁菌門(19株, 5個種)。優勢屬為鹽細菌屬()、動性球菌屬(s)、莫拉氏菌屬()、嗜冷桿菌屬()、節桿菌屬()等(圖6)。優勢種是阿穆斯基灣鹽水桿菌()(22株)、嗜鹽動性球菌()(10株)、鹽晶嗜冷桿菌()(7株)等。從分離培養基來看, R2A上分離83株, 包括變形菌門27株, 15個種, 其次為擬桿菌門(25株, 12個種)、厚壁菌門(15株, 5個種)、放線菌門(16株, 6個種)。這87株菌屬于21個屬, 其中動性球菌屬占優勢, 其次為莫拉氏菌屬、鹽細菌屬、嗜冷桿菌屬等。2216E上共分離46株細菌, 其中放線菌門占優勢(15株, 3個種), 其次為擬桿菌門(14株, 10個種)、變形菌門(13株, 8個種)、厚壁菌門(4株, 2個種)。46株菌分別屬于17個屬, 其中鹽細菌屬占優勢, 其次為嗜冷桿菌屬、動性球菌屬等。R2A上分離出的細菌種類較多, 共分離44個種, 2216E上分離出24個種。在地理位置上, 東部變形菌門占優勢, 其次為擬桿菌門, 在屬水平上嗜冷桿菌屬占優勢, 其次為鹽細菌屬、莫拉氏菌屬等。西部擬桿菌門占優勢, 其次為放線菌門, 屬水平上鹽細菌屬占優勢, 其次為動性球菌屬、嗜冷桿菌屬等。西部細菌多樣性高于東部, 呈現出地理位置上的差異。

圖5 豐度在總豐度前0.5%屬水平的heatmap圖

Fig.5. Bacterial community composion at genus level of the more than 0.5% bacteria

圖6 屬水平上可培養細菌多樣性

Fig.6. Cultivable bacterial diversity at the genus level

依據文獻報道從已測序的菌株中選取酶活研究較少的種屬38株(表3)進行酶活力檢測。其中24株細菌具有淀粉酶活性, 有17株可以降解吐溫20, 12株可以降解吐溫40, 5株可以降解吐溫80, 同時可以降解吐溫20和40的菌株有10株, 同時可以降解吐溫20、40、80的有4株, 具有褐藻膠酶活性的有4株, 具有明膠酶活性的有18株, 具有纖維素酶活性的有4株。其中具有兩種或者兩種以上酶活性的菌株占55%, 表明菲爾德斯半島地區微生物具有較廣泛降解大分子物質的能力。

3 討論

本實驗所用樣品為2016年中國第32次南極科考采集的南極菲爾德斯半島潮間帶19個站位的沉積物。為了研究潮間帶沉積物細菌的群落組成, 我們采用16S rRNA高通量測序技術以及傳統的分離培養法系統地對非可培養以及可培養細菌多樣性進行研究。對高通量結果進行分析, 發現變形菌門、擬桿菌門、放線菌門為主要優勢類群, 其中, 變形菌門中的γ-變形菌綱占比最高, 這與其他的研究結果基本一致[24-25]。擬桿菌門在海洋環境、土壤及沉積物中也是廣泛分布的一個類群, 在本研究中也具有較高豐度(30.15%)。據報道, 該門類細菌可以降解環境中存在的大分子聚合物, 如幾丁質、纖維素等[26],為其他的異養細菌提供能量和營養物質。本研究通過NMDS分析(圖2)發現采取的樣品基本按照東西部進行分離, 可能是因為半島的東海岸多個國家建有科考站, 而西海岸有較多的動物棲息, 造成東西海岸微生物的分布不同[6]。在研究中我們發現位于河口附近的E2、E3以及長城站附近的E9站位微生物組成與其他站位顯著不同, qPCR結果證明這3個站位細菌豐度也較低(表2)。其中黃桿菌綱在E2、E3站位豐度較低, 具體表現為黃桿菌科中的一個還未被分類的類群和屬, 據報道, 海洋來源的黃桿菌具有可以編碼視紫紅質蛋白的基因, 使細菌在營養物質豐富或者缺乏的情況下通過光照獲得能量[27]。其中在這兩個站位中檢測出裝甲菌門(Armatimonadetes)、暗黑菌門(Atribacteria)、迷蹤菌門(Elusimicrobia), 這在其他站位并沒有檢測到。研究表明, 暗黑菌門在缺氧的富甲烷沉積物中比較常見[28]。E9站位中綠彎菌門的厭氧繩菌科(Anaerolineaceae)和δ-變形菌綱(Deltapro-teobacteria)豐度較高。厭氧繩菌科已有研究證明在烴類有機物質多的區域較為豐富[29]。δ-變形菌綱中大多數細菌屬于硫酸鹽氧化菌, 暗示在該站位經常發生硫酸鹽氧化還原反應, 脫硫桿菌()占δ-變形菌綱的63%, 其數量會隨著有機污染的增加而增多[30]。E9站位位于長城站附近, 人類活動對該站位微生物分布具有較大影響[31]。通過db-RDA分析(圖3)發現樣品分布規律與NMDS結果一致, 但環境因子包括溫度、鹽度、pH和葉綠素對各站位微生物群落聚類沒有顯著影響, 表明該地區影響微生物群落結構和分布的主要因素可能仍需要進一步研究。

表3 胞外酶活性檢測

*菌株具有的酶活性以“透明圈直徑/菌落直徑”表示, -表示無活性, W表示活性微弱。

與2012年分析結果(NCBI登錄號為: SRP045912)進行比較后發現, 本研究中的β-變形菌綱、疣微菌門 (Verrucomicrobia)、藍細菌門(Cyanobacteria)、硝化螺菌門(Nitrospirae)具有相對較高的豐度, 厚壁菌門和ε-變形菌綱(Epsilon-proteobacteria)具有相對較低的豐度 (<0.05), 表現出年際變化。有文獻報道, 藍細菌門的光合作用有利于沉積物顆粒形成, 促進有機碳沉淀, 在極地環境中占主導[32]。硝化螺菌門在污水處理廠具有廣泛分布, 可以利用各種有機化合物及亞硝酸鹽等物質[33]。這些結果表明, 相比于2012年, 菲爾德斯半島沉積物中有機物含量可能增加, 導致相關細菌數量發生變化, 這還需要多方面的證據。

對于可培養細菌, 在先前對南極不同地區沉積物微生物多樣性的研究中, 分離出的細菌分屬于變形菌、擬桿菌、放線菌和厚壁菌[34-36]。本研究中分離得到的主要為變形菌, 其次為放線菌、擬桿菌, 這與以往的研究基本一致。丁新彪等[35]從普里茲灣及鄰近海域沉積物中分離出較多假交替單胞菌屬(), 其次為屬科爾韋爾氏菌屬()等。李勝男[37]從南極菲爾德斯半島潮間帶沉積物中分離出較多的假交替單胞菌屬、動性球菌屬、屬、嗜冷桿菌屬等。本研究中優勢屬為鹽細菌屬、嗜冷桿菌屬、莫拉氏菌屬、節桿菌屬等。這與上述結果具有一定的差異, 可能與采樣時間位點及培養方式有關。從分離培養基來看, R2A可以分離出較多種類的細菌, 這在2216E培養基上沒有得到分離, 這也為以后分離菲爾德斯半島可培養細菌提供思路。根據地理位置來看, 門水平上, 東部變形菌門和擬桿菌門占優勢, 西部擬桿菌門和放線菌門占優勢。屬水平上, 東部優勢類群主要為嗜冷桿菌屬, 西部的優勢類群主要是鹽細菌屬, 且西部區域的多樣性高于東部區域, 可能是地理位置對細菌分布產生部分影響。

南極常年冰雪覆蓋, 溫度較低, 微生物能在這種寒冷的條件生存, 細菌體內關于各種代謝的低溫酶起到很大的作用。在先前的研究中, 各國科學家從南極不同地區采集的樣品中分離出可以在低溫條件下具有較強降解酶活性的微生物菌株[38-39]。本研究在較低的溫度下對38株細菌的5種酶活性進行篩選, 其中產淀粉酶的菌株占比較大, 其次為脂肪酶。低溫淀粉酶在工業上主要應用于制作面食, 可以減少發酵時間, 提高口感, 還可以用于造紙、釀造及微生態制劑等多種領域。低溫脂肪酶可以作為洗滌添加劑提高洗滌效果, 也可應用于造紙行業。低溫條件下分離得到的微生物是生產低溫酶的主要來源, 具有良好的應用潛力。

此外, 我們通過非培養方法獲得的優勢菌株中豐度較高的顆粒狀球菌屬、屬、屬、屬并沒有通過可培養的方式分離到。這可能與我們采用的有限的分離培養條件有關。這些類群大多屬于寡營養類群, 且生長緩慢。有報道顆粒狀球菌屬、屬、屬可以用1/10的R2A或者2216E培養基進行分離, 而屬則有專門的R培養基[40-43]。而我們所用培養基沒有經過稀釋, 營養物質較豐富, 因此適合這種培養條件的細菌快速生長后限制了這些寡營養細菌的生長。這提示我們在進行環境微生物分離過程中, 可以通過非培養的結果作為參考, 設計更合理的培養方案, 以提高可培養細菌的多樣性, 更好地利用南極微生物資源。

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BACTERIAL COMMUNITY STRUCTURE OF INTERTIDAL SEDIMENTS IN THE FILDES PENINSULA, ANTARCTICA, AND PRELIMINARY SCREENING OF ENZYME-PRODUCING STRAINS

Wu Leilei1, Shang Li1, Sun Hao1, Shi Xiaochong1,2, Zhang Xiaohua1,2

(1College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China;2Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China)

To study the composition of the bacterial community and enzyme-producing activity of cultivable bacteria in the intertidal sediments of the Fildes Peninsula, Antarctica, sediment samples from 19 sites of the intertidal zone were collected, and the bacterial community composition of these sediments was sequenced by high-throughput sequencing using Illumina MiSeq technology. The absolute abundance of total bacteria in the sediments was measured by real-time PCR. The plate coating method was used to purify and isolate the culturable bacteria of sediment samples from 16 sites. Thirty-eight strains of bacteria were selected for the screening of enzyme activities. In total, 2 375 operational taxonomic units (OTUs) of the intertidal sediment samples were obtained, and these OTUs were assigned into 42 bacterial phyla, of which Proteobacteria, Bacteroidetes, and Actinobacteria were the dominant groups. The abundance of total bacteria ranged from 2.51 × 107to 6.65 × 108copies·g?1. Among culturable bacteria, 129 strains were assigned to four phyla, 25 genera, and 50 species. Proteobacteria, Actinobacteriaand Bacteroides were the predominant groups, which were basically consistent with the results of high-throughput sequencing. Thirty-eight strains were selected for the screening of low-temperature enzyme activities (including lipase, amylase, gelatinase, alginate, and cellulase), and 17 strains were found to produce lipase, 24 strains produced amylase, 18 strains produced gelatin, four strains produced alginate, and four strains produced cellulase.

intertidal sediments of the Fildes Peninsula, high-throughput sequencing, culturable bacteria, 16S rRNA gene, enzyme activity

2019年11月收到來稿, 2019年12月收到修改稿

國家海洋局極地專項(CHINARE-04-01、CHINARE-02-01)資助

吳蕾蕾, 女, 1996年生。碩士生, 主要研究方向為南極微生物多樣性。E-mail: wuleilei0524@163.com

史曉翀, E-mail:shixiaochong@ouc.edu.cn

10. 13679/j.jdyj.20190069