胃癌患者外周血Th17細(xì)胞、血清IL-17、IL-6水平檢測及臨床意義

牟曉映 ，高美華 ，韓春華

1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，山東 青島 266071；

2.青島阜外心血管病醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 青島 266034；

3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 青島 266003

胃癌在我國是最常見的消化道惡性腫瘤之一，死亡率較高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年我國胃癌新發(fā)生病例超過67萬例，死亡病例接近50萬例[1]。中國每年新發(fā)胃癌病例占全球新發(fā)病例的40%以上[2]，給人們生命健康帶來極大危害。近幾年研究發(fā)現(xiàn)胃癌與炎癥密切相關(guān)[3]。炎癥細(xì)胞因子通過炎癥介質(zhì)的釋放誘發(fā)連續(xù)的炎癥反應(yīng)，激活一系列免疫反應(yīng)促進(jìn)癌癥細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤血管生成，抑制免疫系統(tǒng)[4]。Th17細(xì)胞作為新型的效應(yīng)T細(xì)胞，被視為炎癥反應(yīng)重要調(diào)節(jié)因子，Th17細(xì)胞及其特征性細(xì)胞因子白介素17(IL-17)是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與多種炎性疾病、自身免疫疾病、腫瘤的發(fā)展[5-7]。白介素6(IL-6)作為免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，既參與炎癥反應(yīng)，又參與Thl7細(xì)胞的增殖和分化。本文以胃癌患者為研究對象，檢測其外周血Thl7細(xì)胞與血清IL-17、IL-6水平，并分析其在胃癌中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取青島大學(xué)附屬醫(yī)院2017年1月至2017年12月收治的40例胃癌患者為觀察組，同時(shí)選取同期來院體檢的健康者40例作為對照組。所有患者手術(shù)前均未接受過放療、化療，且無傳染病及自身免疫性疾病史，未使用過免疫抑制劑，所有患者術(shù)后均經(jīng)病理診斷證實(shí)為胃癌。觀察組患者中男性21例，女性19例；年齡46～76歲，中位年齡63歲；所有患者均按照國際抗癌協(xié)會(huì)臨床TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中Ⅰ+Ⅱ期25例，Ⅲ+Ⅳ期15例；低分化22例，中高分化18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。對照組中男性23例，女性17例；年齡32～77歲，中位年齡51歲。

1.2 標(biāo)本采集 觀察組于手術(shù)前一天清晨、對照組于體檢當(dāng)日清晨空腹抽取靜脈血3 mL置于肝素抗凝管中，立即輕輕顛倒混勻5～10次，用于Thl7細(xì)胞頻率檢測；3 mL血液置于無添加劑生化管中，待凝固后離心分離血清，分裝，-80℃冰箱保存，檢測IL-17、IL-6濃度。

1.3 檢測儀器及試劑 流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，人輔助性Th17細(xì)胞檢測試劑盒、抗人CD4-FITC抗體、抗人 PE-抗IL-17、同型對照PE-IgG1購自美國eBio-science公司，MK3酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司，血清IL-17、IL-6 ELISA試劑盒購自武漢基因美公司。

1.4 方法

1.4.1 外周血液中Th17細(xì)胞頻率檢測 取已經(jīng)編號的各組研究對象空腹留取的肝素抗凝靜脈血3 mL，加入紅細(xì)胞裂解液1 mL，室溫條件下避光孵育10 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清，滴加1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞。向各試管中加入佛波酯(PMA)50 μg/L、離子霉素(Ion)1 μg/L、莫能霉素1 μL/mL，并充分混勻置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。吸取試管中樣本至EP管內(nèi)，2 500 r/min離心6 min，棄上清，PBS沖洗。各測定管分別加入抗人CD4-FITC抗體，同型對照管加入等量的同型對照抗體PE-IgG1，室溫避光30 min，再用PBS洗2次，每管加入300 μL固定液，4℃避光孵育15 min。離心，棄上清。加入破膜液，3 000 r/min離心，棄上清，PBS洗2次，各實(shí)驗(yàn)組分別加入20 μL PE-抗IL-17，對照組加入10 μL同型對照PE-IgG1，室溫避光30 min。PBS洗2次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸。2 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.4.2 血清IL-17、IL-6檢測 取待測標(biāo)本血清，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，本試劑盒采用雙抗體夾心法進(jìn)行檢測，使用MK3酶標(biāo)儀在450 nm下測定吸光度(OD值)，通過設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算樣品中IL-17、IL-6濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者的Th17細(xì)胞頻率表達(dá)和血清IL-17、IL-6水平比較 觀察組患者的Th17細(xì)胞頻率、血清IL-17和IL-6水平明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組受檢者的Th17細(xì)胞頻率表達(dá)和血清IL-17、IL-6水平比較()

表1 兩組受檢者的Th17細(xì)胞頻率表達(dá)和血清IL-17、IL-6水平比較()

images/BZ_35_1267_561_2267_624.png觀察組對照組t值P值40 40 1.32±0.23 0.79±0.15 11.51＜0.05 11.55±2.45 8.68±1.69 6.45＜0.05 199.45±24.42 80.36±14.86 26.08＜0.05

2.2 觀察組患者Th17細(xì)胞頻率表達(dá)、血清IL-17、IL-6水平與臨床特征的關(guān)系 觀察組患者Th17細(xì)胞頻率表達(dá)、血清IL-17、IL-6水平與臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，與性別、年齡無關(guān)(P＞0.05)，見表2。

表2 Th17細(xì)胞的頻率表達(dá)和血清中IL-17、IL-6的水平與胃癌患者臨床特征的關(guān)系

3 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，遺傳和環(huán)境因素是影響胃癌發(fā)生發(fā)展的主要因素，有胃癌發(fā)生的患者其后代發(fā)生胃癌的比例比無家族遺傳史的人明顯要高，同時(shí)吸煙、喝酒以及食鹽攝入量、腌制食品食用量、深加工肉制品攝取量、新鮮蔬菜水果食用量、幽門螺桿菌感染情況均與胃癌的發(fā)生有相關(guān)性[8-11]。胃癌作為多因素所致的腫瘤疾病，其診斷金標(biāo)準(zhǔn)為胃鏡檢查，但胃鏡檢查患者耐受性低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本又高，很多患者不易接受，血清標(biāo)志物檢測易于取材，成本較低，快速又準(zhǔn)確，更利于癌癥患者的早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療，提高患者生存率。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞及其產(chǎn)生的IL-17在腫瘤診斷中的作用越來越被重視，其在腫瘤組織、免疫微環(huán)境、血液中的改變可引起腫瘤發(fā)生變化。Th17細(xì)胞是新興的輔助性CD4+T細(xì)胞亞群，由IL-6和TGF-β共同啟動(dòng)其分化發(fā)育，由IL-23誘導(dǎo)其分化成熟并產(chǎn)生特異性因子IL-17。李巧霞等[12]報(bào)道胃癌患者外周血中TH17細(xì)胞比例顯著增多，且與非癌對照組織相比，觀察組織內(nèi)CD4+/IL-17+細(xì)胞浸潤明顯增多。本研究運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血中Th17細(xì)胞頻率，用ELISA試驗(yàn)檢測IL-17血清濃度。結(jié)果顯示，與健康體檢者(0.79±0.15)%相比，胃癌患者外周血中Th17細(xì)胞頻率(1.32±0.23)%顯著增高；胃癌患者血清IL-17濃度為(11.55±2.45)pg/mL，明顯高于健康體檢者的(8.68±1.69)pg/mL，與其研究結(jié)果相一致。李清靖等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Thl7細(xì)胞比例的增多與胃癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Th17細(xì)胞頻率、IL-17濃度水平與患者胃癌分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度相關(guān)，Ⅲ+Ⅳ期患者高于Ⅰ+Ⅱ期患者，低分化患者高于中高分化患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

IL-6是一種具有多向性、多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，是參與TH17細(xì)胞活化啟動(dòng)所必需的細(xì)胞因子之一[14]，IL-17升高誘導(dǎo)IL-6表達(dá)增加，同時(shí)IL-6增加誘導(dǎo)TH17細(xì)胞生成更多的IL-17[15]。本研究中胃癌患者血清IL-6濃度明顯高于健康體檢者，IL-6濃度與患者年齡、性別無關(guān)，與患者臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，晚期患者高于早期患者，低分化患者高于中高分化患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這一結(jié)果與王丹[16]研究結(jié)果一致。IL-6可能通過促進(jìn)瘤內(nèi)血管的生成、調(diào)控細(xì)胞生成基因、加快腫瘤干細(xì)胞增殖以及產(chǎn)生適應(yīng)腫瘤生長的炎癥環(huán)境等作用機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[17]。本研究表明胃癌患者Thl7細(xì)胞頻率、IL-17、IL-6增高，導(dǎo)致患者體內(nèi)免疫功能發(fā)生紊亂，Thl7細(xì)胞、IL-17、IL-6可能共同參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。

蔣偉等[18]報(bào)道微環(huán)境中Thl7細(xì)胞的表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后呈正相關(guān)，而ZENG等[19]報(bào)道觀察組織中IL-17高表達(dá)患者總生存率較差，彭春偉等[20]報(bào)道IL-6表達(dá)水平對預(yù)測胃癌患者的生存期無臨床價(jià)值。本文在Thl7/IL-17、IL-6對胃癌動(dòng)態(tài)發(fā)展的影響以及對胃癌的預(yù)后價(jià)值這兩方面仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，胃癌患者血液中TH17、IL-17和IL-6高表達(dá)，Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子與胃癌密切相關(guān)，炎性細(xì)胞因子可能在胃癌的診斷治療方面發(fā)揮更重要的作用。