miRNA-486、miRNA-200和miRNA-10b在肺癌患者血液中的表達及臨床意義

李逸軒，付君婷，鄧小剛，段欣汝，韓淳，呂鵬飛，3，鄺仕成，2，肖莎

1.海南醫學院公共衛生學院環境衛生與職業醫學教研室，海南 海口 571199；

2.海南醫學院附屬海南醫院藥學部，海南 海口 570311；

3.海南醫學院第一附屬醫院乳腺外科，海南 海口 570102

肺癌是全球癌癥患者死亡的首要原因[1]，如何控制和預防肺癌已成為全世界范圍內的關注焦點。由于肺癌的發生和惡化是多種因素導致的，并且沒有很好的特效藥，因此近幾年肺癌的患病率和死亡率均呈現升高趨勢。在肺癌的診療過程中，早期肺癌由于不具有典型的臨床癥狀(如咳嗽，胸痛等)，從而導致檢出率較低，而中后期肺癌治療的預后效果并未能達到人群預期效果，且對患者機體產生較大傷害，較高的花費同樣為社會的醫療增添負擔，因此探尋可篩查出早期肺癌的生物標記物具有重要的臨床意義。目前臨床上仍無法對早期肺癌做出準確的篩查，而非編碼小分子RNA在一些惡性腫瘤中的表達存在特異性，研究人員認為這一發現對深入探討更加高效的肺癌早期診斷具有重要的意義。

非編碼小分子RNA(microRNAs，miRNAs)是一類長21～25個核苷酸的小分子，對機體的生長發育、細胞繁殖、代謝、凋亡等生理過程發揮著重要作用[2]，其作用機制是特異性結合靶基因mRNAs上的3'非編碼區域，干擾mRNAs在轉錄后的基因表達或蛋白質翻譯，從而干擾一系列的正常基因表達的生物學進程。在腫瘤的發生與發展過程中，miRNA起著致癌或者抑癌基因的作用，而引起腫瘤組織的非正常增生以及浸潤[3]。目前研究發現在肝癌、甲狀腺癌、結直腸癌、乳腺癌以及肺癌等多種實體性惡性腫瘤中，miRNA-486、miRNA-200和miRNA-10b在腫瘤組織中存在不同程度的上調或下調的表達狀態，結果發現，肝癌患者機體miRNA-486的表達量顯著降低[4]，miRNA-10b在肺癌患者血液中呈低表達[5]，可以用于早期篩查的重要指標。本研究旨在探討miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b在肺癌患者與非肺癌患者血液中表達的差異性，分析其在肺癌患者血液中的表達與肺癌遺傳易感性是否有關聯。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用病例對照研究方法，選擇2012年1月至2016年7月期間海南醫學院附屬海南醫院呼吸內科的93例肺癌患者作為病例組，41例非肺癌患者作為對照組。在簽署知情同意書后，開展問卷調查，記錄人口學特征、既往病史、家族病史及生活方式(吸煙、飲酒)等一般情況。規定平均每天吸煙大于1支的并且超過半年的定義為吸煙者，規定平均每天飲酒大于1兩的并且超過半年的定義為飲酒者。

1.2 血液樣本的采集 利用經過枸櫞酸鈉抗凝處理過的真空采血管采集研究對象的外周靜脈血6 mL，4℃冰箱保存，采集血液樣本當天完成其miRNA提取。

1.3 miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b的相對表達水平檢測 遵循北京全式金生物技術(Trans-Gen Biotech)有限公司提供的操作程序提取miRNA，使用由TransGen Biotech提供的反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，再使用miRNAreal-time PCR反應試劑盒(Trans-Gen Biotech)進行擴增反應，總體系為20 μL，PCR正向引物 (10 μmol/L)0.4 μL，PCR 反向引物 (10 μmol/L)0.4 μL，2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix 10.0 μL，Passive Reference Dye(50×)(optional)5.2 μL，ddH2O 2.0 μL，DNA模板2.0 μL。以U6作為內參考基因，血液miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b水平的相對表達量采用2-△Ct表示，△Ct486=Ct486-CtU6，△Ct200=Ct200-CtU6，△Ct10b=Ct10b-CtU6。匯總3次獨立實驗結果，進行統計學分析。

1.4 統計學方法 利用EXCEL2010、SPSS25.0軟件進行數據分析。計量資料中滿足正態性分布的采用均數±標準差()描述，組間比較采用t檢驗，不滿足正態性分布的采用中位數和四分位間距[M(P25，P75)]描述，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，計數資料采用例數描述，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的基本情況比較 兩組患者的性別、年齡、吸煙史、飲酒史比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組患者的基本情況比較

2.2 兩組患者的血液miRNA相對表達水平比較 病例組患者的血液miRNA-486相對表達水平明顯低于對照組、miRNA-10b相對表達水平明顯高于對照組，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。但兩組患者的血液miRNA-200相對表達水平比較差異無統計學意義 (P＞0.05)，見表2。

表2 兩組患者的血液miRNA相對表達水平比較[M(P25，P75)]

2.3 病例組患者血液中miRNA的相對表達水平與臨床特征的關系 病例組患者血液中的miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b相對表達水平在性別、年齡、吸煙史、飲酒史方面比較差異均無統計學意義 (P＞0.05)，見表3～表5。

表3 病例組血漿中miR-486的表達與臨床特征的關系[M(P25，P75)]

?images/BZ_14_1270_276_2266_334.png性別-0.1890.850男女35.25(33.21，36.78)35.13(33.35，36.95)年齡(歲)0～60 61～100吸煙史-0.0080.994 35.24(33.39，36.87)35.16(33.17，36.69)-0.3830.702有無35.21(32.26，36.85)35.11(34.21，36.68)飲酒史-0.6800.496有無34.81(32.31，36.17)35.17(33.30，36.80)

?臨床特征性別miR-200Z值-0.997 P值0.319男女35.54(34.00，36.86)35.78(34.75，37.69)年齡(歲)0～60 61～100吸煙史-0.1940.846 35.44(34.27，36.98)35.73(33.96，36.93)-0.6040.546有無35.59(33.94，36.91)35.69(34.27，37.61)飲酒史-1.3310.183有無34.71(34.10，37.33)36.07(34.27，36.94)

3 討論

由于臨床上對肺癌的診斷多依靠病理檢驗取患者的組織進行活檢，會對患者造成機體的創傷且對早期肺癌進行篩查時無法做到大面積推廣，血清標記物用于篩查早期肺癌具有創傷小、高效性和易于推廣的特點。miRNA一直作為國內外學者近幾年研究腫瘤作用的熱點相關分子，均有大量研究實驗證明miRNA分子可以作為特異性診斷腫瘤的生物標志物，其中miR-486、miRNA-200、miRNA-10b是與腫瘤發生相關的重要生物標志物。本次研究前期采用高通量測序技術檢測海南地區漢族肺癌患者和對照患者血液中差異表達的miRNA，在初次實驗采用高通量測序時研究發現miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b的表達差異性顯著，且均呈下調狀態[6]。因此，研究人員通過real-time PCR法檢測93例肺癌患者和41例非肺癌患者血液miRNA-486、miRNA-200、miRNA-10b的表達水平，進一步驗證高通量測序結果。

本研究結果發現miRNA-486在兩組患者血液中的表達具有差異性，肺癌患者血液中miRNA-486的表達量顯著低于對照組患者與諸多學者研究結論相一致。楊陽等[7]和姜溪[8]同樣發現在肺癌患者血漿中miRNA-486的表達下調，可以作為肺癌潛在篩查及預后的生物指標，黃馨萍等[4]、何佳等[9]研究發現miRNA-486在肝癌組織中低表達，安學鳳等[10]研究結果顯示早期乳腺癌患者的血清中miR-486呈低表達，可以作為特異性診斷早期乳腺癌的生物標志物。另外，本研究發現miRNA-10b在肺癌患者血液中相對表達水平顯著高于對照組。楊云龍等[11]研究也發現非小細胞肺癌患者外周血單核細胞中miRNA-10b的表達量顯著高于健康者，可作為非小細胞肺癌的早期篩查和治療的重要指標。miRNA-200家族在腫瘤患者體內是一個重要的參考指標，其包括miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141 和 miRNA-429[11]。鄧超等[12]研究提示病例組患者血清中miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-141的相對表達量顯著低于健康組。JING等[13]通過transwell和尾靜脈注射法測定miR-200c和USP25在遷移/侵襲和肺轉移形成中的作用，發現miR-200c可通過抑制USP25表達對，從而起到對非小細胞肺癌發揮腫瘤抑制的作用。但在探討miRNA-200在肺癌患者血液中相對表達時，本研究并未發現miRNA-200在兩組患者血液中的表達有顯著性差異。對比其他學者的實驗過程，本組研究人員探討其原因可能是沒有進行miRNA相應家族各個指標的分析，僅僅進行了一個綜合表達量的檢測。提示在今后的研究中應進一步探討肺癌患者血液中miRNA-200各家族其他指標的表達量。

本研究尚存在一定的不足之處，在深入探究病例組miR-486和miRNA-10b的表達情況與其性別、年齡、吸煙史、飲酒史的關聯時，結果均不具有統計學意義。分析其原因可能為研究樣本數量過少，存在偏倚現象，在以后的研究中應考慮擴大樣本容量。

綜上所述，miRNAs在肺癌發生發展過程中起著癌基因或抑癌基因的作用也預示著它將為肺癌患者早期診斷提供了可能。miR-486和miRNA-10b可作為肺癌遺傳易感性生物標志物。