生防菌Bacillus safensis的鑒定及其對核桃病原菌的抑菌特性

張知曉，戶連榮，劉 凌，季 梅

(云南省林業和草原科學院，云南 昆明 650201)

核桃(Juglansregia)學名胡桃，是多年生落葉喬木，核桃仁是高檔堅果，其種殼能開發成工藝品，木材是制作高檔家具的原料，葉子及果皮可以入藥。因核桃具有良好經濟社會價值，云南省將核桃作為發展八大產業的重要物種之一及打造云南“綠色食品牌”的重要組成部分[1]。近些年來，核桃的種植面積快速增加，有數據顯示，截至2017年，云南省核桃種植面積達286.67萬hm2，核桃(干果)總產量為115萬t，產值318億元，居全國首位[2]。但核桃病蟲害發生較嚴重。在云南省，核桃黑斑病、炭疽病、枝枯病及根腐病等發生普遍，對核桃生產造成了嚴重影響[3]。目前，防治病害仍然依賴化學藥劑，鑒于人們對綠色無公害食品需求以及生態環境保護意識的提高，生物防治成為核桃病害防治的重要發展方向之一。

芽孢桿菌具有抗逆能力強、抑菌譜廣的特點，近些年研究較多的如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslincheniformis)等，在由絲狀真菌引起的植物病害的生防領域有廣泛應用[4]。而芽孢桿菌資源豐富，還有許多具有生防效果的種類等待發掘研究。芽孢桿菌抑菌譜廣泛，但不同菌株對不同病原菌抑制效果不一，且不同芽孢桿菌抑制病原菌的作用機制不同[5]，因此，在發掘新生防菌資源的同時，有必要對其抑菌特性進行研究。鑒于此，選用前期試驗分離驗證的具有抑菌效果的1株生防細菌7-3，對其進行分類鑒定，并測定其對核桃主要真菌病害的抑菌特性，為開發新的生防微生物資源及將生防微生物菌株應用于核桃病害防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試生防菌 菌株7-3由云南省林業和草原科學院核桃有害生物綠色防控技術集成與產品開發項目組，于2019年4月在云南省昆明樹木園(東經102°44′48″、北緯25°8′39″)核桃根際土壤中分離篩選得到。

1.1.2 供試病原菌 病原菌7株，均為前述項目組前期分離鑒定的病原菌：鏈格孢菌(Alternariaalternate)，菌株編號B1；胡桃葉點霉菌(Phyllostictajuglandis)，菌株編號B2；間座殼菌(Diaporthenobilis)，菌株編號B3；鐮孢菌(Fusariumsp.)，菌株編號B4；胡桃楸擬莖點菌(Phomopsisjuglandina)，菌株編號B5；膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporiodes)，菌株編號B6；廣布擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisdisseminata)，菌株編號B7。

1.1.3 供試培養基 LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，pH值自然，用于生防細菌培養及形態鑒定。

PDA培養基：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，pH值自然，用于病原真菌培養及對峙培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防細菌鑒定 形態觀察：將菌株7-3在LB固體培養基上劃線培養，在37 ℃恒溫培養箱中培養48 h后觀察菌落生長情況，并用革蘭氏染色法制片完成細胞形態結構的顯微觀察[6]。

生理生化特性鑒定：完成菌株溫度(5～60 ℃)、pH值(4.0～13.0)、NaCl(0～12%)耐受試驗，測定其水解淀粉和明膠能力，用葡萄糖、麥芽糖、乳糖等碳源及硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等氮源進行唯一碳氮源的生長試驗[7]。

16S rRNA序列測定：采用DNA提取試劑盒按照操作說明提取菌株的基因組總DNA，用細菌通用引物27F/1492R擴增16S rRNA片段，用1%瓊脂糖凝膠電泳回收擴增產物，送深圳華大基因有限公司進行測序。將獲得的基因序列與GenBank中已知的核酸序列進行BLAST比對，選取相關近緣種序列用MEGA 4.1軟件進行系統發育分析，采用鄰接距離法構建系統發育樹[8]。

1.2.2 生防菌對核桃主要病原真菌拮抗功能評價 采用平板對峙試驗測試生防菌株7-3發酵液對7種病原菌的抑菌效果。用5 mm的打孔器沿菌落邊緣選取新鮮的菌絲制成菌餅，單個菌餅接種在PDA培養基平板中央，用移液器吸取50 μL生防菌發酵液，均勻對稱地接種在距菌餅中央30 mm處的4個點，以接無菌水為對照(CK)。于 28 ℃下培養，每個處理3次重復。待對照組菌落長滿平板后，分別測量對照菌落半徑(R)、處理菌落半徑(r)，計算抑制率。抑制率=[(R-r)/(R-2.5)]×100%。

1.2.3 生防菌對核桃主要病原菌孢子的影響 試驗采用隨機區組設計，共4個處理：活體發酵液處理、發酵濾液處理、發酵滅菌濾液處理、對照(CK)，每個處理重復3次。其中，活體發酵液：將菌株7-3接種于PDA培養液，28 ℃、140 r/min搖床培養24 h，將菌液稀釋為2×109cfu/mL的活體菌液；發酵濾液：將2×109cfu/mL的活體菌液用細菌濾器過濾3次后的濾出液；發酵滅菌濾液：將2×109cfu/mL的活體菌液經121 ℃滅菌20 min后，用細菌濾器過濾1次的濾出液；對照：121 ℃滅菌20 min的滅菌自來水。

病原菌孢子懸浮液制備：用無菌水沖洗PDA培養基上培養5 d的廣布擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisdisseminata)分生孢子，離心沉淀分生孢子。反復清洗3次后，配制成4×106個/mL的孢子懸浮液。

混合培養觀察：將分生孢子懸浮液分別和上述4個處理的液體按1∶1混合，置于離心管中，28 ℃、140 r/min搖床黑暗恒溫培養，分別于12、24 h后，用無菌移液器吸取病原菌孢子，在光學顯微鏡下觀察其形態，并拍攝照片。

2 結果與分析

2.1 核桃病原菌生防細菌鑒定

2.1.1 菌株形態鑒定 如圖1，將菌株7-3在固體LB培養基上劃線培養3 d后，其菌落為淡黃色，邊緣呈波浪狀，表面粗糙，中央無凸起，干燥。顯微鏡下觀察到菌株菌體直桿狀，單個，兩端鈍圓，革蘭氏染色呈陽性。

A：在固體培養基上的菌落形態；B：革蘭氏染色結果

2.1.2 生理生化鑒定 菌株生理生化特征檢測結果(表1)顯示，該菌株能利用葡萄糖、麥芽糖、核糖、甘油、蔗糖、甘露醇、D-果糖、D-核糖和海藻糖作為唯一碳源進行生長，能利用硝酸銨、氯化銨、酪氨酸、組氨酸作為唯一氮源進行生長，生長溫度在10～50 ℃，生長pH值在5.0～9.0，能耐受10%的NaCl，具有水解明膠的能力，不能水解淀粉。

表1 生防菌株7-3的生理生化特性

2.1.3 16S rRNA序列測定及系統發育學分析 利用16S rRNA通用引物，以菌株7-3 DNA 為模板進行PCR擴增，測序得到了長度為1 372 bp 的16S rRNA基因片段(登錄號：MT378305)。將測序獲得的序列在NCBI上進行核苷酸同源性比對，結果顯示，其與沙福芽孢桿菌(Bacillussafensis)的16S rRNA核苷酸序列同源性最高，達到100%。選取其相關近緣種，采用鄰接距離法構建系統發育樹，結果(圖2)顯示，菌株7-3與沙福芽孢桿菌同聚一支，親緣關系最近。結合形態及生理生化試驗結果，初步鑒定菌株7-3為沙福芽孢桿菌(Bacillussafensis)。

圖2 生防菌株7-3的16S rRNA系統發育樹

2.2 核桃病原菌生防細菌拮抗功能評價

菌株7-3對7株核桃病原真菌均表現出不同程度的抑制作用(圖3)，對鏈格孢菌(Alternariaalternate,B1)、胡桃葉點霉菌(Phyllostictajuglandis,B2)、間座殼菌(Diaporthenobilis,B3)、鐮孢菌(Fusariumsp.,B4)、胡桃楸擬莖點菌(Phomopsisjuglandina,B5)、廣布擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisdisseminata,B7)的抑制率在50%以上，抑制效果十分明顯。其中，對間座殼菌(Diaporthenobilis,B3)的抑制率最高，達到82.9%(圖4)。在所測植物病原真菌中，菌株7-3對膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporiodes,B6)的抑制率最低，僅為47.5%。

2.3 生防細菌對核桃病原菌分生孢子萌發的影響

觀察培養12 h后的孢子萌發情況(圖5)，發現對照的孢子開始萌發，孢子第3色胞略微膨大變圓，產生粗細均勻的芽管和菌絲。加入活體發酵液處理的擬盤多毛孢菌(P.disseminata)孢子嚴重畸形，孢子第3色胞和基部無色胞膨大變形，且基部無色胞多呈囊泡狀；加入發酵濾液處理的孢子不萌發，孢子第3色胞膨大變形明顯；加入發酵滅菌濾液處理的孢子幾乎不萌發，孢子第3色胞膨大變形明顯。

A：12 h后活體發酵液孢子形態；B：12 h后發酵濾液孢子形態；C：12 h后發酵滅菌濾液孢子形態；D：12 h后對照孢子形態；E：24 h后活體發酵液孢子形態；F：24 h后發酵濾液孢子形態；G：24 h后發酵滅菌濾液孢子形態；H：24 h后對照孢子形態

觀察培養24 h后的孢子萌發情況發現，對照的病原菌已經形成濃密的菌絲團，菌絲生長粗細均勻，排列整齊，菌絲表面光滑透明，內部物質分布均勻。加入活體發酵液處理的細菌黏附在病原菌擬盤多毛孢菌(P.disseminata)孢子周圍，病原菌孢子分散，第3色胞和基部無色胞體壁破裂乃至溶解，胞質外泄，活體菌群的大量黏附，加大了病原孢子畸形及破裂的程度；加入發酵濾液處理的孢子聚集成團，均不萌發，孢子第3色胞變形嚴重，且呈囊泡狀畸形；加入發酵滅菌濾液處理的孢子能夠萌發，但萌發率降低，萌發形成菌絲團，與正常菌絲相比，整體粗短，排列雜亂，孢子形成菌絲處瘤狀突起，末端出現異常分枝，菌絲不能正常生長，表明其抑菌能力具有高度穩定性。

3 結論與討論

經過前期生防菌的篩選，發現菌株7-3對病原真菌有良好的抑菌效果，通過生理生化、形態觀察和分子生物學相結合的方法，將菌株7-3鑒定為沙福芽孢桿菌(Bacillussafensis)。沙福芽孢桿菌在許多方面具有應用價值，如用于發酵獲得新型纖溶酶[9]、果膠酶[10]、細胞外RNase[11]及角蛋白酶[12]等，而其產生的木聚糖酶以及絲氨酸堿性蛋白酶分別在造紙工業[13]及洗滌劑工業[14]中具有廣闊的應用前景，該菌還被用于發酵生產生物表面活性劑[15]，制備調味品香蘭素[16]，其生物合成的聚羥基丁酸酯(PHB)，可被用于制造生物降解塑料[17]。該菌在油田防腐蝕領域[18]、廢水處理[19]及碳匯領域的應用[20]都有報道。在農業領域，沙福芽孢桿菌被報道具有促進植物生長[21]、修復有毒微量元素[22]、石油[23]及農藥[24-25]造成的土壤污染的作用。其中，生防方面已有研究顯示，沙福芽孢桿菌對番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)[26]、煙草黑脛病(Phytophthoraparasitica)[27]、硫酸鹽還原菌SRB[18]、細菌性枯萎病(Pseudomonassp.)[28]、水稻稻瘟病(Magnaportheoryzae)[29]、巴氏絲核菌(Rhizoctoniabataticola)[30]等多種病原真菌及細菌均有一定的抑制活性，此外，還有學者對其殺蟲[31]及誘導植株抗性[32]的能力進行了研究。

目前，核桃病害的防治仍以化學防治為主，搭配育種及修枝、清落葉等營林措施[33]，其中化學農藥難免對生態環境造成破壞，育種及營造健康林均需要漫長周期，生物災害突發時難以應對。生物防治技術因其見效快，對生態環境友好，滿足食品安全需求的優點，近幾年發展迅速。本研究中，菌株7-3能對鏈格孢菌(Alternariaalternate)、胡桃葉點霉菌(Phyllostictajuglandis)、間座殼菌(Diaporthenobilis)、鐮孢菌(Fusariumsp.)、胡桃楸擬莖點菌(Phomopsisjuglandina)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporiodes)和廣布擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisdisseminata)7種核桃病原真菌產生抑菌作用，結合前人的相關研究，認為沙福芽孢桿菌是一種潛力生防菌，抑菌能力強，抑菌譜廣。RONG等[29]對沙福芽孢桿菌的抑菌物質進行分析，證實iturin A2和iturin A6 可改變菌絲膜的通透性。本研究結果顯示，菌株5-1經液體發酵后能夠使病原菌分生孢子及菌絲畸形，進而抑制其萌發及生長，菌群黏附性強，且抑菌能力穩定，這些特征表明其在核桃生防領域具有廣闊的應用開發前景。然而關于該菌株的研究才剛剛起步，要將其應用于核桃病害的生物防治還需對其代謝途徑、功能機制等進行深入研究，同時還要開展大量的田間防效試驗。