基于單克隆抗體的膠體金免疫層析法快速檢測丙溴磷

王兆芹，張富生，鄧家軍，馬玉華，崔廷婷,3，崔 娜，萬宇平,3

(1.北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206；2.江西省農產品質量安全檢測中心，江西 南昌 330046；3.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心，北京 102206)

丙溴磷(Profenofos)是一種廣譜高效、中等毒性的非內吸性有機磷殺蟲劑，具有觸殺和胃毒作用，主要用于防治蔬菜水果及糧食作物上的害蟲[1]。但隨著其使用量日漸增多，必然會對環境及食品造成污染[2-3]，危害人類健康。目前已有研究表明，丙溴磷可破壞中樞神經系統膽堿能神經的正常功能[4-5]，還對紅細胞有明顯毒性[6]。因此，我國GB 2763—2019中規定了不同食品中丙溴磷的殘留限量[7]。

目前已報道的檢測丙溴磷殘留的方法主要有色譜法[8-10]和色譜質譜聯用技術[11-13]，這些方法靈敏度和準確度較好，但樣品前處理復雜，需要昂貴的儀器設備及專業的技術人員，不適合基層實驗室推廣使用。為滿足大量樣品現場快速檢測的需要，基于免疫層析技術，研制了丙溴磷的膠體金快速檢測試紙條，具有操作簡便、檢測速度快、成本低等優點，適用于蔬菜中丙溴磷殘留的現場快速篩查和檢測。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

丙溴磷(純度≥99%)、三氯硫磷、四氯化碳、丁硫醇、5-溴-3-氯-2-羥基苯甲酸、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、羊抗鼠IgG、氯金酸、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)[西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司]，檸檬酸三鈉、碳酸鉀(K2CO3)(廣州化學試劑廠)，丙溴磷單克隆抗體(北京勤邦生物技術有限公司)，碳酸氫鈉、無水乙醇、三氯甲烷、乙腈、氫氧化鉀(KOH)、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、蔗糖(北京化學試劑公司)，底板、樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜(NC膜)、吸水墊(上海捷寧生物科技有限公司)。

1.2 儀器與設備

2000SBL電子天平(美國Setra公司)、SBCJ磁力攪拌加熱器(河南圣亞儀器儀表有限公司)、TGL16C臺式高速冷凍離心機(湖南湘立科學儀器有限公司)、XYZ 3050膠體金點樣系統(美國BioDot公司)、CT300數控切條機(上海金標生物科技有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 半抗原的合成 丙溴磷半抗原的合成如圖1所示。取1.67 g三氯硫磷加100 mL四氯化碳溶解，冷卻到0～5 ℃，加入丁硫醇1.8 g、碳酸氫鈉0.78 g，持續攪拌2 h，停止反應，加入0～5 ℃水80 mL，轉移到分液漏斗中，快速振蕩，靜置分層，除去水相，有機相濃縮蒸干得到中間體1；在中間體1中加入50 mL 0～5 ℃無水乙醇溶解，加無水碳酸鉀1.38 g，該溫度下繼續攪拌1 h，停止反應；加入0～5 ℃水120 mL、三氯甲烷150 mL，充分振蕩，于分液漏斗中靜置分層，除去水相，有機相濃縮蒸干得到中間體2；在中間體2中加入80 mL乙腈溶解，加5-溴-3-氯-2-羥基苯甲酸2.58 g、KOH 1.23 g，室溫攪拌3 h，停止反應，旋轉蒸干，加水，用乙酸乙酯萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥處理后蒸干，用硅膠柱純化，再用二氯甲烷和甲醇體積比為10∶1的混合溶劑洗脫分離，得到丙溴磷半抗原。

圖1 丙溴磷半抗原的合成流程

1.3.2 包被原的制備 采用活潑酯法將丙溴磷半抗原與OVA偶聯制備包被原。將9.3 mg半抗原溶于1 mL DMF中，加入8.3 mg NHS、10.1 mg EDC，室溫反應3 h，得到半抗原溶液A液；將50 mg OVA溶于0.05 mol/L 磷酸緩沖液(PB)中，得到B液；將A液滴加到B液中，4 ℃反應12 h，用0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液透析純化3 d，每天換液3次，得到丙溴磷半抗原-OVA偶聯物，即為包被原，分裝、-20 ℃保存。

1.3.3 金標抗體的制備 參考檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒[14]，再將丙溴磷單克隆抗體標記到納米金表面上。在磁力攪拌下，用0.2 mol/L K2CO3溶液將膠體金溶液的pH值調節至7.2，按每1 mL膠體金溶液中加入30 μg抗體的標準向其中加入丙溴磷單克隆抗體，攪拌混勻，室溫靜置10 min，加入10% BSA至其終質量分數為1%，靜置10 min。然后以12 000 r/min于4 ℃離心40 min，棄去上清液，沉淀用含0.5% BSA、0.05% Triton X-100的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌2次后復溶，在4 ℃下保存備用。

1.3.4 試紙條的制備 以包被原和羊抗鼠IgG分別作為NC膜上的檢測線(T線)和質控線(C線)，采用BioDot劃膜儀進行劃線，兩線相隔5 mm，噴量1 μL/cm，使包被原質量濃度為0.4 mg/mL，羊抗鼠IgG質量濃度為0.2 mg/mL。將包被好的NC膜置于37 ℃干燥2 h，備用。

將樣品墊置于處理液中浸泡2 h，37 ℃干燥2 h備用；將金標墊置于處理液中均勻浸濕1 h，37 ℃干燥3 h后，用噴膜儀將金標抗體按0.01 mL/cm的量均勻噴涂在金標墊上，37 ℃干燥1 h，備用。

試紙條由底板、樣品墊、金標墊、NC膜和吸水墊組成。依次將NC膜、金標墊、樣品墊、吸水墊粘貼于底板上，貼好后切成3 mm寬的試紙條，裝在特制的塑料制卡中置于密封袋內，加干燥劑，密封，4 ℃保存。

1.3.5 墊材處理液的優化

1.3.5.1 金標墊展開劑的選擇 以含0.5% BSA的0.02 mol/L PB作為基礎液，配制A、B、C、D、E 5種不同展開劑(表1)作為金標墊處理液，并按1.3.4步驟將液體處理到金標墊上，處理干燥后的金標墊滴加2 μL 10%的金標抗體并干燥，滴加80 μL經前處理的陰性菜心樣品，觀察顯色情況，篩選合適的金標墊展開劑。

1.3.5.2 樣品墊展開劑的選擇 將A、B、C、D、E 5種不同展開劑(表1)按1.3.4步驟處理到樣品墊上，組裝試紙條后配合已確定的金標墊使用，對比5種展開劑對膠體金層析速度、樣品流動性的作用及顯色情況，篩選合適的樣品墊展開劑。

表1 展開劑組分

1.3.6 樣品處理與檢測 將新鮮樣品擦去泥土(不可水洗)，剪碎成小于1 cm的碎片或細碎小丁；稱取1.0 g剪碎的樣品至10 mL離心管中，加入6 mL 0.02 mol/L PB緩沖液(pH值7.0)，蓋上蓋子，手動振蕩30 s，靜置1 min，上清液即為待測液。吸取80 μL待測液垂直滴于試紙條加樣孔中，液體流動開始計時，反應10 min，肉眼判定結果。

若T線顯色等于或強于C線，表示待測液中不含丙溴磷或其含量低于方法檢出限，判為陰性(-)；若T線不出現或出現但顯色明顯弱于C線，則結果為陽性(+)；若C線不可見，則檢測結果無效。

1.3.7 試紙條性能測定

1.3.7.1 方法檢出限 選取空白菜心、白菜、油麥菜、豇豆樣本，分別添加丙溴磷標準品至含量為0、0.05、0.10、0.20 mg/kg，按1.3.6步驟進行前處理，用試紙條進行檢測。

1.3.7.2 重復性 測試基質為菜心，采用空白樣本及丙溴磷添加含量為0.10 mg/kg的加標樣本進行驗證，取3個批號的試紙條進行檢測，每一水平10平行，計算POD值(檢出陽性結果次數占所有檢測結果的比率)。

1.3.7.3 其他性能指標 隨機選取空白菜心、白菜、油麥菜、豇豆樣本共50份，分別添加丙溴磷標準品至含量為1.3.7.1所確定的方法檢出限的0.5、1.0、2.0倍水平，共計樣品200份，用試紙條進行檢測，根據《食品快速檢測方法評價技術規范》[15]計算靈敏度等性能指標。

2 結果與分析

2.1 金標墊展開劑的選擇

金標墊釋放速度過快會引起釋放不均勻，表現在C、T線顯色時線條不均勻；而釋放速度過慢則會影響顯色[16]。金標墊展開劑的選擇主要解決金標抗體釋放不均勻問題，提高釋放速度。本研究采用5種不同配比方式的展開劑，如表2所示，不同展開劑對金標抗體釋放情況影響顯著，B顯色最深，但均勻度不佳，影響觀測效果；E顯色均勻，但釋放速度過慢。綜合考慮幾個性能，選擇展開劑C作為金標墊處理液。

表2 不同金標墊展開劑的選擇結果

2.2 樣品墊展開劑的選擇

展開劑中添加非離子表面活性劑Triton X-100，可起到增溶、潤濕的作用；而糖類的加入可改善界面親水狀態，從而提高樣液層析的潤濕效率，使層析過程更穩定[17]。由表3可知，不同展開劑對樣本的流動速度及顯色差異較大。綜合考慮層析速度與顯色情況，選擇展開劑E作為樣品墊處理液。

表3 不同樣品墊展開劑的選擇結果

2.3 方法檢出限的測定

由圖2可知，當丙溴磷含量不斷上升時，試紙條T線顏色由深變淺。當丙溴磷含量為0.10 mg/kg時，觀察到T線顏色明顯弱于C線，因此確定試紙條對丙溴磷的檢出限為0.10 mg/kg。

圖2 試紙條檢出限測試結果

2.4 重復性測試

由表4可知，3個不同批號試紙條的檢測結果中，僅批次2的試紙條在檢測中出現陽性反應，其他無明顯差異，表明方法重復性較好。

表4 試紙條重復性測試結果

2.5 其他性能指標測試

根據《食品快速檢測方法評價技術規范》，試紙條靈敏度、特異性、假陰性率、假陽性率、相對準確度各性能指標的計算方法及結果見表5。試驗中共計樣品200份，其中陰性100份(包括空白樣品和添加含量為0.5倍檢出限的樣品各50份)，陽性100份(包括添加含量為檢出限和2倍檢出限的樣品各50份)。

3 結論與討論

目前還沒有關于丙溴磷的膠體金免疫層析方法的報道，僅是開發針對有機磷類農藥的單克隆抗體并建立免疫檢測方法，如劉賢進等[18]設計采用二乙基膦酸乙酸作為通用結構半抗原，用NHS-DCC法和EDC法合成2種人工抗原免疫新西蘭大白兔制備抗血清，所得抗體對毒死蜱、氧樂果、二嗪農、乙基對硫磷、丙溴磷、辛硫磷等農藥有特異性反應，50%抑制濃度(IC50)分別為0.12、0.21、0.24、0.78、0.97、3.80 μg/mL；張麗杰等[19]制備針對乙氧基磷酸酯類有機磷農藥的單克隆抗體，對毒死蜱、對硫磷、丙溴磷、氧化樂果、除線磷、二嗪農、溴硫磷、辛硫磷、喹硫磷、三唑磷等農藥有特異性反應，并以此為基礎建立了該類農藥的快速免疫篩選檢測方法；朱亮亮等[20]通過制備有機磷農藥半抗原，研制出一種能夠檢測蔬菜、水果中有機磷農藥的膠體金免疫層析試紙條，對辛硫磷、對硫磷、丙溴磷、氯唑磷的檢測限均為200 μg/kg。上述研究都是以有機磷農藥的共有特征結構為基礎制備半抗原，免疫所得單克隆抗體可以檢測多種農藥，針對丙溴磷檢測的特異性較差。本研究通過在丙溴磷的苯環上引入羧基活性基團制備得到半抗原，該半抗原保留了丙溴磷的所有特征基團，最小改變丙溴磷原有結構特征，同時與載體蛋白偶聯后，突出的是丙溴磷本身獨有的含磷部分的結構，為后續刺激動物免疫應答產生特異性更強、靈敏度更高的抗體奠定了基礎；基于此半抗原制備的丙溴磷快速檢測試紙條，可特異性地快速檢測蔬菜中的丙溴磷，檢出限達到0.10 mg/kg；靈敏度96%、特異性93%、假陰性率4%、假陽性率7%、相對準確度94.5%，重復性較好，檢測速度快，從制樣到得出結果僅需15 min。

本試紙條與儀器方法相比，具有操作簡便、檢測速度快、成本低等優點，但由于膠體金免疫層析法主要通過肉眼觀察顏色來判斷結果，可能出現假陽性等問題。因此對于陽性樣品，還需要用儀器方法進行確證。盡管如此，該方法作為一種快速篩查手段，可廣泛用于蔬菜中丙溴磷殘留的現場篩查和檢測，具有重要的經濟價值和社會價值。