K12A 全自動凱氏定氮儀測定核桃蛋白質含量

谷 瑤，曾永明，陳松武，楊 漓，周麗珠

（廣西壯族自治區林業科學研究院，廣西南寧 530002）

核桃（Juglans sigillataL.），屬胡桃科（Juglandaceae） 植物，最初產于西亞、歐洲的東部和南部[1-3]。核桃仁含有豐富的蛋白質、脂肪和碳水化合物，每100 g 含蛋白質15～20 g，是一種公認的高蛋白的食品，有“長壽果”“養生之寶”的美譽。同時，也含有人體必需的鈣、磷、鐵等多種微量元素和礦物質，以及胡蘿卜素、核黃素等多種維生素，對人體有益，是深受老百姓喜愛的堅果類食品之一[4]。核桃仁中可溶性蛋白的組成以谷氨酸為主，其次為精氨酸和天冬氨酸[1]。

食品中蛋白質的測定方法有兩類：直接法和間接法[5]。杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法是使用最廣泛的間接法[6-7]，而近紅外光譜法、紫外分光光度法、電泳法、紫外吸收光譜法和Bradford 法是常見的直接法[5]。凱氏定氮法靈因敏度高、穩定性好、成本低廉，是目前進行氮含量測定常見的方法，也是國內外法定的檢測方法[8]。目前，大量文獻報道了凱氏定氮法測定食品中蛋白質，但針對特定食品蛋白質的研究僅限于大豆、小麥、乳制品和大米[9-15]。由于食品基質復雜，普適性方法需要根據實際情況進行適當調整和改進，有必要針對性地建立核桃蛋白質檢測方法，在最短的時間內得到更精準的結果。試驗參照《GB 5009.5—2016 食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法測定核桃仁中蛋白質含量[16]，通過進行方法優化，得到精準的含量值，為核桃蛋白質快速、準確測定提供了科學參考。

方法原理：蛋白質是含氮的有機化合物。核桃與硫酸和催化劑一同加熱消解，使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以鹽酸標準溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質含量。其反應式如下：

1 材料與方法

1.1 試劑

硫酸銅（CuSO4·5H2O）、硫酸鉀（K2SO4）、硫酸（H2SO4）、硼酸（H3BO3）、甲基紅指示劑（C15H15N3O2）、溴甲酚綠指示劑（C21H14Br4O5S）、氫氧化鈉（NaOH）、95%乙醇（C2H5OH）、鹽酸（HCl）、無水碳酸鈉（Na2CO3） 基準試劑、硫酸銨（(NH4)2SO4） 標準品，除非另有說明，所用試劑均為分析純，水為三級水。

試驗原料：核桃，廣西鳳山縣核桃專業合作社提供。

1.2 試劑配制

（1）硼酸溶液（20 g/L）。稱取20 g 硼酸，加水溶解后并稀釋至1 000 mL。

（2）氫氧化鈉溶液（30%）。稱取300 g 氫氧化鈉加水溶解后，放冷，并稀釋至1 000 mL。

（3）鹽酸標準滴定溶液[C(HCl)]0.1 moL/L。量取9 mL 分析純濃鹽酸（HCl）于1 000 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，搖勻；稱取于270～300 ℃高溫爐中灼燒至恒質量的工作基準試劑無水碳酸鈉0.2 g（精確到0.000 1 g）溶于50 mL 水中，加10 滴溴甲酚綠- 甲基紅指示液，用配制的鹽酸溶液滴定至溶液由綠色變為暗紅色，煮沸2 min，加蓋具鈉石灰管的橡膠塞，冷卻，繼續滴定至溶液再呈暗紅色；同時做空白試驗，準確計算鹽酸標準滴定溶液濃度[C（HCl）]。

（4）甲基紅乙醇溶液（1 g/L）。稱取0.1 g 甲基紅溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。

（5）溴甲酚綠乙醇溶液（1 g/L）。稱取0.1 g 溴甲酚綠，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。

（6）混合指示液。1 份甲基紅乙醇溶液與3 份溴甲酚綠乙醇溶液現配現用。

（7）吸收液。溶液（1） 和（6）混合均勻而成。

1.3 儀器和設備

ME204/02 型分析天平（感量為1 mg），梅特勒- 托利多儀器（上海） 有限公司產品；K12A 型全自動凱氏定氮儀，上海晟聲自動化分析儀器有限公司產品；SH230N 型石墨爐消解儀，山東海能科學儀器有限公司產品；DFT-200C 型超高速粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司產品。

1.4 試驗步驟

1.4.1 制樣

將經60 ℃烘干的核桃去殼，核桃含油量大，打碎混勻呈泥狀，采取減量法稱質量。

1.4.2 消解

核桃消解條件：稱取核桃樣品0.5 g（精確至0.000 1 g）于干燥消解管內，依次加入5 g 硫酸鉀，0.5 g 硫酸銅，10 mL 濃硫酸，將消解爐設置為一階段220 ℃20 min，二階段440 ℃75 min（消解爐可提前預熱至220 ℃），放入樣品，打開尾氣回收，待時間結束，可觀察樣品，與試劑空白一樣呈澄清，有淡綠色即為消解完全，靜置冷卻。

1.4.3 蒸餾

檢查并補充蒸餾水桶、堿液桶、硼酸桶、標液瓶內試劑；打開電源開關，同時打開自來水閥；在“維護”欄“初始化滴定器”1 次，“清洗滴定缸”3次；開機時，手動先排空酸、堿管氣體（點擊“維護”再點擊“酸泵”“堿泵”），并置換標液（點擊“初始化滴定器”3 次），點擊“清洗滴定缸”3 次；點擊“參數設置”輸入“標液濃度”“換算系數”數值；安裝一空消化管，關閉安全門，點擊“測試”，點擊“工作模式”選擇“空白測試”，設置堿液量10 mL，吸收液量30 mL，點擊“運行”空蒸，當連續2 次空白值相差不大于0.1 mL，取后1 次空白值為儀器空白（消解樣空白此時可測），然后把空白值輸入“維護”中“參數設置”輸入“空白”數據；測定前應先用(NH4)2SO4標準品做氮回收率的測定，借以驗證所用儀器、試劑及操作等條件的可靠性；要求(NH4)2SO4標準品氮回收率為95%～105%；點擊“測試”依次輸入“樣品量”“吸收液量”（30 mL） “堿液量（60 mL）”，然后安裝樣品，點擊“運行”。工作完成后，點擊“數據”尋找對應的樣品編號，點擊編號調出測試結果，并記錄；全部測試結束，點擊“維護”“清洗滴定缸”，關閉電源、水源。

2 結果與分析

核桃樣品中蛋白質的含量按以下公式計算：

式中：X——試樣中蛋白質的含量，g/100 g；

V1——試液消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，mL；

V2——試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，mL；

C——硫酸或鹽酸標準滴定溶液濃度，mol/L；

0.014 0——鹽酸[C(HCl)=1.000 mol/L]標準滴定溶液相當的氮的質量，g；

m——試樣的質量，g；

V3——吸取消化液的體積，mL；

F——氮換算為蛋白質的系數，核桃中氮轉換系數為5.30；

100——換算系數。

核桃樣品中的蛋白質含量見表1。

表1 核桃樣品中的蛋白質含量

3 結論

（1） 核桃含蛋白與脂肪偏高，一階段消解產生碳化會在消解管內鼓泡，但只要不超過整體消解管1/3 高度；在二階段時，會有硫酸回流將管壁上的樣品沖回，若炭化情況劇烈，可考慮適當降低一階段溫度、延長時間使反應緩和。

（2） 采用K12A 全自動凱氏定氮儀測定核桃中蛋白質的含量平均為15.826 6%，相對標準偏差為0.302 0% （n=6），該方法具有準確、快速、簡便、低耗和穩定的優點，是核桃中蛋白質含量測定的首選方法。