腫瘤驅動基因拷貝數變異檢測的應用研究進展

王冰，王軍，楊忠，王會如（通信作者）

1 北京市醫療器械檢驗所 （北京 101111）；2 北京理工大學生命學院 （北京 100081）

腫瘤個體化治療需要闡明個體患者的遺傳傾向、腫瘤組織組成、腫瘤組織學圖譜、組織微環境、并發癥、生活方式和生命質量等各個方面[1]。腫瘤的形成是一個多步驟的過程，究其根本是由遺傳變異的積累所導致的。這些遺傳變異包括腫瘤驅動基因或抑癌基因的拷貝數變異（copy number variation，CNV）、單核苷酸變異（single nucleotide variants，SNV）、插入缺失突變（insertion-deletion mutation，In/Del）、融合變異（fusion mutation）及染色體倍性的變化[2]。腫瘤驅動基因CNV是腫瘤細胞基因組變異檢測的重要生物標志物，臨床上針對發生CNV的靶標選擇合適的靶向藥物，合理改進治療方案，使治療更有針對性，避免患者產生不良反應及過度醫療的發生。

分子診斷試劑、生化診斷試劑與免疫診斷試劑共同組成了體外診斷（in vitro diagnostics，IVD）試劑的版圖，其中，腫瘤驅動基因CNV 的檢測也覆蓋了IVD 試劑的各個層面。熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和免疫組化（immunohistochemistry，IHC）是臨床上檢測腫瘤組織驅動基因CNV 的常規方法，但只能定性地對CNV 進行分析。基因檢測技術的創新和迭代使得CNV 的定量檢測成為可能，在腫瘤驅動基因CNV 檢測領域展現出巨大優勢。但是，基因檢測技術對檢測環境要求高，操作流程復雜，樣本制備和檢測流程標準化、自動化程度低，且人員操作的熟練度和規范程度各不相同，導致檢測結果存在較大差異，缺乏可比性。因此，研制用于CNV 檢測的分子IVD 試劑溯源的標準物質，對助力腫瘤驅動基因CNV 分子診斷試劑的研發、注冊和監管以及分子實驗室檢測能力的規范和提升具有重要意義。

1 腫瘤驅動基因CNV 致癌機制

CNV 是遺傳變異的重要來源，是一種大于1 kb 的DNA片段的變異，變異片段發生重復且與個體間基因組片段重復數量存在差異[3]，包括了缺失、重復、倒位及易位等多種變異形式，極大地豐富了基因組遺傳變異的多樣性[4]。CNV 在人類基因組中廣泛分布，一般表現為兩種模式：一種是有絲分裂過程中染色體分離異常而發生的廣泛性CNV（broader CNV，bCNV），重復區域可以發生在染色體臂的大部分區域[5]；另一種是由于DNA 的修復錯誤導致的發生在染色體臂小范圍內的局灶性CNV（focal CNV，fCNV）[6]。fCNV 更頻繁地發生在腫瘤驅動基因上[3，7]。CNV 如果發生在腫瘤相關基因序列內部或周圍可能引起癌基因激活、抑癌基因失活.最終導致腫瘤的發生。CNV 通過改變基因劑量、調節基因活性影響基因表達、表型差異和表型適應，從而引起腫瘤以及其他遺傳疾病[8]。

Diskin 等[9]分析了成神經細胞瘤易感基因的CNV，發現1q21.1區域的CNV 與成神經細胞瘤的發生高度相關，該區域拷貝數的變化使得成神經細胞瘤斷裂點家族23（neuroblastoma breakpoint family 23，NBPF23）的基因表達量顯著上調。紀念斯隆凱特琳癌癥中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，MSK）Chris Sander 團隊利用癌癥基因組圖譜TCGA 中涉及12個腫瘤類型的3 299個腫瘤組織樣本基因組學數據，提取了數千個發生變異的遺傳和表觀遺傳特征，將所有腫瘤分為體細胞基因突變類（mutations，M Class）和拷貝數變化類（copy number changes，C class），多種類型的肺癌、乳腺癌、卵巢癌和子宮內膜癌等都屬于C 類。這些腫瘤CNV 研究對于今后C 類腫瘤患者的治療是至關重要的[10]。有研究顯示，在非小細胞肺癌中，CNV 和免疫相關基因表達譜（gene expression profiling，GEP）在預測免疫治療臨床獲益方面有重要價值[11]。胃腸道腫瘤免疫檢查點抑制劑（immune-checkpoint-blockade，ICB）治療中，CNV 的預測和預后價值存在顯著相關性。Lu 等采用全外顯子測序等方法，比較分析了CNV 負荷、腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）和程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）等分子特征在胃腸道腫瘤患者的預測及預后意義。結果表明，腫瘤CNV 負荷與胃腸道腫瘤患者免疫治療臨床獲益相關，且較低的CNV 負荷的患者接受ICB 治療療效及預后較好。CNV 負荷有成為新的胃腸道腫瘤免疫治療生物標志物的巨大潛力[12]。

在如肺癌、乳腺癌和胃癌等許多人類惡性腫瘤的發病機制中，表皮細胞生長因子受體基因（epidermal growth factor receptor，EGFR）、人表皮生長因子受體-2基因（human epidermal growth factor receptor 2，HER2 ）以及間質 - 上皮細胞轉化因子基因（mesenchymal-epithelial transition factor,MET）的擴增和由此導致的對應蛋白質表達量的增加發揮了重要作用。

EGFR也稱受體酪氨酸激酶1基因（receptor tyrosineprotein kinase erbB-1, ERBB1），位于人7號染色體短臂上，長度約192 kbp，含有28個外顯子，屬于人類表皮因子受體基因家族4個成員之一。EGFR屬于表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）細胞增殖、信號轉導的受體，主要由胞外功能區、跨膜區和胞內區3部分組成。其中胞外功能區是聯結EGF的主要配體，胞內區存在突出的酪氨酸激酶活性物質，當EGFR聯結于配體后，于細胞外組成同源二聚體、異源二聚體等物質，并隨著二聚體內陷變化，而出現構象變化，導致分子自身逐漸磷酸化激活，形成有絲分裂樣表現，酪氨酸經磷酸化后，可激活分子位點、引發信號傳導機制及激活下游等多個通路。其中EGFR的18-21號外顯子編碼酪氨酸激酶結構域，該區域發生突變后一般會導致該結構域活性增強。小分子抑制劑與該區域結合，阻止受體出現磷酸化，阻斷下游信號通路[13]。研究認為EGFR基因的擴增與胃-食管交界處和遠端食管的腸道腺癌[14]以及非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[15]的發生相關聯，可以作為判斷響應抗EGFR靶向治療的療效和預后的生物標記物。Knebel等通過對NSCLC患者連續抽血進行液體活檢來檢測EGFR的突變，提出了“EGFR的擴增是NSCLC患者對奧希替尼（osimertinib）產生耐藥性的一種機制”的假說[16]。

HER2基因也稱為受體酪氨酸激酶2基因（receptor tyrosine-protein kinase erb-2，ERBB2），位于人17號染色體長臂上，長度約為42.5 kbp，含有31個外顯子，屬于人類表皮因子受體基因家族4個成員之一，該家族表達酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTKs）跨膜蛋白受體[17]。HER-2蛋白介導的信號轉導途徑主要有Ras/Raf/分裂素活化 蛋 白 激 酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑、磷脂酰肌醇-3-羥基激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）/Akt 途徑和信號轉導及轉錄激活（signal transducer and activator of transcription，STAT） 途 徑 等[18-20]。 這 些 通路與細胞增殖密切相關，HER2發生擴增時，其蛋白質表達量增加，進而開啟上述信號通路的轉導，促進細胞快速增殖，抑制細胞凋亡，促使腫瘤的形成[21]。研究認為，HER2的擴增與乳腺癌患者的預后密切相關[22]。在HER2發生擴增的乳腺癌治療過程中，針對HER2的單克隆抗體能夠極大改善HER2陽性乳腺癌患者的預后，例如曲妥珠單抗（trastuzumab）就有非常好的療效[23]。

MET 基因表達的蛋白質一般稱為c-MET，位于人7號染色體長臂上，長度約為125 kb，含有21個外顯子，是一種具有高度結合性的受體酪氨酸激酶，屬于RON 亞族。MET 在多種人類腫瘤中呈現異常表達，表現為細胞活性異常或者遺傳信息的改變[24]。c-MET 是肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）唯一已知受體。HGF 與c-Met 胞外域結合后，誘導c-Met 激酶結構域發生磷酸化，激活下游信號通路，引起蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK），進而激活酪氨酸殘基自身磷酸化，激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路，信號傳導入細胞核，促進細胞增殖、分化或引起細胞形態改變及侵襲運動。NSCLC 中，c-MET磷酸化激活下游PI3K/Akt 通路，導致腫瘤對吉非替尼耐藥。c-MET 小分子酪氨酸酶抑制劑也是目前臨床試驗廣泛研究的重點[25]。c-MET 蛋白的表達情況也與乳腺癌[26]、結直腸癌[27]以及胃癌[28]等癌癥的發生發展密切相關。

2 腫瘤驅動基因CNV 檢測方法比較

FISH是檢測細胞核基因組CNV的傳統方法，IHC進一步驗證該基因擴增后蛋白質表達量的水平，但這兩種方法實驗過程煩瑣、周期長、檢測成本偏高，而且需要經驗豐富的病理科醫師對結果進行解讀，對結果的解釋主觀性較強[29]。隨著遺傳學、分子生物學和基因組學等學科的發展，出現了多種檢測CNV的方法，包括比較基因組雜交（comparative genome hybridization，CGH）、多重鏈接探針擴增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、SNP芯片（SNP-chip microarray）、定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）、數字聚合酶鏈反應（digital polymerase chain reaction，dPCR）以及高通量測序（next-generation sequencing，NGS）等。隨著NGS和dPCR技術的迅速發展，使得此兩種技術用于CNV檢測優勢得到凸顯，能夠克服傳統方法的只能定性不能定量的缺點，實現對CNV的絕對定量[30]。

但是NGS 與第三代PCR 新技術dPCR 相比，其在對CNV 進行定值時會呈現高度的復雜性。美國國家標準與技 術 研 究 院（National Institute of Standards and Technology，NIST）開發了兩套適用于腫瘤驅動基因CNV 檢測的標準物質，一套是基于qPCR 和dPCR 技術定值的HER2基因拷貝數變化的有證標準物質2373（standard reference material?2373，SRM 2373），對5個細胞系的HER2拷貝數比率進行了賦值，并評定了其不確定度[31]；另一套是僅使用dPCR方法定值的EGFR 和MET 基因拷貝數變化的標準物質8366（reference material 8366，RM 8366），對6個細胞系的EGFR 和MET 基因的拷貝數比率進行了賦值，并評定了其不確定度[32]。Lih 等使用該HER2的標準物質比較了不同測序方法檢測HER2拷貝數的能力，包括了靶向區域測序、全外顯子測序以及全基因組測序。盡管不同NGS 測序方法對HER2 CNV 的檢測呈現較好的重復性，但是仍表現出基于平臺特異性的拷貝數檢測值之間的偏倚。這與不同實驗室間所用建庫方法和生物信息分析流程的差異高度相關。而dPCR 由于其簡便的實驗流程和分析方法，使得不同dPCR平臺間的分析結果更具可比性，準確度和精確度更高[33]。He 等同樣利用包括全基因組測序、全外顯子組測序和靶向區域測序（2個不同的泛癌種多基因panel）的NGS 方法對RM 8366的EGFR 和MET 基因的拷貝數比率進行測定，并與dPCR 方法賦予的量值進行比較。結果顯示其中5個細胞系中，NGS 與dPCR 的檢測結果具有比較好的一致性（20%以內的偏差），只在另外1個細胞系中，NGS 的檢測結果顯著偏低。這與Lih 等的研究結論類似，不同的NGS 方法之間的檢測結果間會呈現可見的差異[32]。研究證實，dPCR 對CNV 的檢測分辨力可以低至0.1個拷貝[34]。隨著dPCR 技術的進步，其在CNV 檢測方面的研究也越來越多，dPCR 必然隨著大量臨床數據的積累和檢測成本的降低在臨床上得到進一步推廣。由于其檢測流程的簡便性和對檢測結果的精確定值，未來可與NGS、FISH 和IHC 等方法互為補充。

然而dPCR 技術仍面臨諸多不足和挑戰，例如腫瘤組織或者體液類樣本的高度異質性、腫瘤細胞比例偏低、所用引物的擴增效率，以及檢測限或者灰區的確定都有可能造成CNV 臨床檢測結果的假陰性或者假陽性。因此dPCR儀器的性能、dPCR 診斷試劑盒適用的檢測范圍和分析結果的可靠性等問題是CNV 檢測能否順利實現的關鍵影響因素。因此，標準物質對于CNV 檢測是必不可少的，是衡量檢測結果是否準確的一把標尺。

對各種技術分析的匯總見表1。

3 腫瘤驅動基因CNV IVD 試劑的現狀

應用于臨床的腫瘤驅動基因CNV 檢測試劑必須依據相關的法律法規由國家相關部門進行監督管理，試劑又分為取得醫療器械注冊證的商品化IVD 試劑和實驗室自建方法（laboratory-developed tests，LDTs）兩類。IVD 試劑注冊和上市后的監管屬于國家藥品監督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）所屬相關部門的工作職責，LDTs 屬于臨床實驗室監管的部分[35]。

3.1 取得醫療器械注冊證的商品化IVD 試劑

在檢測CNV 的方法中，由于FISH、qPCR 和dPCR 等技術相對于NGS，具有檢測流程簡單、周期短和檢測靶標較少的特點，適合開發成商品化試劑盒并以取得醫療器械注冊證的形式應用于臨床。若基于NGS 技術開發的試劑盒檢測靶點明確且較少，亦可以通過此種方式進入臨床。根據《體外診斷試劑注冊管理辦法》，與腫瘤驅動基因CNV檢測相關的試劑均屬于第三類產品，需經藥品監督管理部門審批注冊，方可進入臨床[36]。目前已經取得醫療器械注冊證的檢測CNV 的IVD 試劑包括了FISH、qPCR 和dPCR等方法。

表1 腫瘤驅動基因組CNV 檢測方法比較

3.2 LDTs

在國家精準醫療戰略大背景下，基于NGS 的腫瘤基因測序正在被臨床接受和認可。NGS 可以同時檢測更多的靶標和變異類型，不但可以檢測已知變異，還可以發現更多與疾病相關的未知變異。正是由于NGS 可以檢測成百上千甚至數十萬個位點，甚至是全基因組測序30億個堿基的檢測，很難按照IVD 注冊的要求對每個檢測位點的分析有效性和臨床有效性進行評價。將CNV 與SNP、Fusion 和TMB 等腫瘤生物標志物放在一起進行檢測，尤其是最新研究證實CNV 負荷也可以作為免疫治療的生物標志物[37]，選用數百個基因大panel 的靶向測序或者全外顯子組測序是最優選擇。由于方法的高度復雜性，基因變異研究、藥物研發進展與日俱進，建庫方法、數據庫和分析軟件頻發地更新迭代，以LDTs 的形式進入臨床是最合適的選擇，并以風險管理的方式由相關部門進行監管。例如美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的 MSK 的可檢測468個基因的 IMPACT NGS 檢測試劑和Foundation Medicine 的 可 檢 測324個 基 因 的 FoundationOne CDx（F1CDx）檢測試劑，均為LDTs，并非是可用于銷售的IVD 產品，只能在申報批準的CLIA 認證實驗室內檢測，這也是與美國的醫療保險制度有關[35]。隨著我國《醫療器械監督管理條例》的不斷完善和成熟，國家對LDTs 的監管也將更合理規范。

無論腫瘤驅動基因CNV 檢測試劑是以檢測較少靶點的IVD 商品化試劑，還是以將多種生物標志物糅合在數百個基因大panel 的LDTs 的形式服務于臨床，從監管的角度對試劑本身的質量要求是一致的。而如何使檢測結果準確度高、重復性好，需要腫瘤驅動基因CNV 核酸標準物質的應用。從CNV 檢測試劑的研發、生產和使用的各個階段，從產品質量控制和校準的角度，都需要有參照標準，即標準物質。

4 腫瘤驅動基因CNV 核酸標準物質研制進展

標準物質（reference materials，RM）是指具有足夠均勻和穩定的特定特性的物質，其特性適用于測量或標稱特性檢查中的預期用途[38]。經過賦值的標準物質可以用于校準、測量準確度控制以及測量精密度控制。標準物質在校準測量儀器、評價測量分析方法、測量物質特性值和考核操作分析人員的操作技術水平，以及生產過程中產品的質量控制等領域具有不可或缺的作用。使用標準物質通過對儀器和試劑進行校準、對檢測方法進行評價，可以有效減少實驗誤差，提高檢測結果的準確性。標準物質是臨床分子診斷標準化的核心，臨床檢測的某一標本中特定標志物的量值，不管用何種方法測定，均可以通過統一的標準化物質，而得到相近的結果，其量值均可溯源至同一標準，從而具有可比性[39]。

按照對IVD 試劑監管的要求，診斷試劑在注冊檢驗階段需要使用國家參考品或者標準物質對試劑盒的性能進行評價，實現溯源的要求[36，40]。目前國內還沒有推出腫瘤驅動基因CNV 檢測的有證標準物質或者國家參考品。因此，研發腫瘤驅動基因CNV 檢測用的標準物質，滿足IVD 領域的市場需求，規范行業標準具有重要意義。在CNV 分子診斷試劑研發、注冊、上市后的監督抽驗以及實際的臨床檢驗中，采用可靠的標準物質是定性和定量測量方法的性能確認和驗證、測量方法產品校準品的量值傳遞、實驗室運行測量程序的質量控制以及能力比對和驗證的基礎和保障。NIST 發布了SRM 2373和RM 8336兩種用于腫瘤驅動基因CNV 檢測的標準物質，其中前者用于HER2 CNV 的檢測，后者用于對EGFR 和MET 兩個基因CNV 的檢測，適用于dPCR 以及NGS 等檢測方法。兩套標準物質均以目的基因發生CNV 的永生化腫瘤細胞系為原材料進行培養，提取核基因組DNA 制備得到CNV 水平不同的標準物質核酸溶液。SRM 2373由標物研制實驗室使用qPCR 和dPCR 方法對標準物質的特性值進行賦值和不確定度評定。RM 8366僅使用dPCR 方法在標物研制實驗室完成了定值和不確定度評定，這是因為dPCR 在拷貝數絕對定量的準確度方面是顯著高于qPCR 的。特性值是以拷貝數比率來表示，即靶基因的拷貝數濃度與內參基因的拷貝數濃度的比值。隨后，RM 8366的特性值又在另外2家實驗室的數字PCR 平臺進行測定，結果顯示，2家實驗室的結果與NIST 的特性值都呈現非常好的相關性[31-33]。這些標準物質將有助于提高使用dPCR 和NGS 方法研究和臨床檢測重要腫瘤治療靶點的CNV 的準確度和可信度。

5 小結

腫瘤驅動基因CNV 作為腫瘤細胞基因組中的一種重要變異類型，是腫瘤患者靶向治療、療效監測和預后評價的重要生物標志物，CNV 負荷在免疫治療中發揮的重要價值正在被越來越多的研究證實。依據檢測靶標的類型、數目以及所用的方法，靈活選擇是包裝成商品化試劑盒通過NMPA 的注冊審批，還是以LDTs 的形式進入臨床應用。技術的進步和法律法規的不斷完善也推動監管機構研制出權威的、有證的、不同應用場景的腫瘤驅動基因CNV 核酸標準物質，為CNV 檢測系統的量值溯源和質量管理提供支撐，實現CNV 從定性檢測向精確定量檢測的真正轉變。